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产气荚膜梭菌病诊断技术

阅读:1550          发布时间:2011-4-21
  (1)检样中肠毒素检测取腹泻粪便加入生理盐水做成1:10的乳剂,离心后取上清液置微量U形底孔反应板上。以二倍递增稀释法稀释,做成以下三列。
  
  *列:检样稀释液+致敏红细胞(或致敏乳胶粒)。
  
  第二列:检样稀释液+未致敏的红细胞(或未致敏的乳胶粒)。
  
  第三列:已知量的肠毒素稀释液+致敏红细胞(或致敏乳胶粒)。
  
  RPHA在2h,RPLA在5~10h后进行凝集判断。若*列与第二列反应阳性的终点相同,则认为有非特异性凝集存在。在这种情况下,可于检样中加入等量的50%未致敏的血细胞(或乳胶粒)进行吸收后离心,取上清液再次进行试验。确定非特异性凝集吸收后,即可与第三列对照作比较,计算出毒素含量。
  
  (2)培养液中肠毒素测定在产气荚膜芽孢形成初期的菌体中含有肠毒素,当芽孢成熟,菌体崩解时即游离到培养液中。因此可用产芽孢培养基24~48h培养后,用超声波或溶菌酶处理,破坏菌体,离心所得到的上清液作检样。芽孢形成可用相差显微镜查明。肠毒素测定方法可用RPHA或RPLA。对培养液中肠毒素用RPHA或RPLA检测时,几乎看不到非特异性反应。
  
  (3)分离菌肠毒素产生性试验产气荚膜梭菌在试管内不易形成芽孢,故有时即使为食物中毒菌A型、C型或D型,也有看不到芽孢、测不到肠毒素的情形。常给予75~C20min的反复热刺激促使芽孢形成,并用促芽孢培养基。分离菌的肠毒素产生试验程序如下。
  
  被检菌液0.1-0.5ml,接种庖肉培养基,置37~C2~4h后,进行75℃20min热水浴处理,取出再置37~C2-4h再进行热处理。必要时可重复3~4次。取出0.1-0.5ml转种于硫乙醇钠培养基37~C6h,再接种促芽孢培养基37~C72h,取少许涂片镜检·,观察有无芽孢形成。若见到芽孢可进行肠毒素测定。
  
  (4)其他毒素测定。从食品检样中提取毒素可以25g无脂肪检样在lOOmlHEPES[N-(2-hydroxyethyl)peraz洫e-N,-2-ethaesulfonicacid]缓冲液中,以300r/min绞切1rain。将匀质物在5℃下,以20000r/min离心20min。取上清置冰箱内1~2h,用滤膜滤器滤过灭菌。置滤液于透析袋内,在15%一30%聚乙烯乙二醇(相对分子质量为20000)透析到少于lOml。可供下述各项试验用。
  
  溶血试验取o.5ml10.5%绵羊红细胞悬液于小试管内,加上述毒素抽提液0.5ml,置37℃水浴中经30min、60min、120min和24h,分别观察溶血情况。
  
  致死试验取0.2ml毒素抽提液注射几只小白鼠尾静脉内(或腹腔内注射o.5m1),观察3天,看其有无死亡。
  
  坏死试验以o.2ml毒素抽提液注射于家兔腹部皮下,连续3天观察注射局部有无坏死现象。
  
  将毒素抽提液以0.5ml量分别与0.5ml抗产气荚膜梭菌的标准血清(主要是A型至E型的抗毒素)混合,然后注射于小白鼠腹腔内,观察3天,看注射小鼠有无死亡。根据注射小鼠被动保护作用,确定毒素型别。
  
  注:HEPES缓冲液使用浓度一般为10-50mmol/L,可以根据缓冲液能力的要求而定。
  
  10mmol/LHEPES的配制,称取0.2385gHEPES,加入到l00ml培养液内溶解,用lmol/L氢氧化钠调至pH7.o~7.2,过滤除菌后使用。

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