蛋白质纯化技术服务

1、 蛋白质纯化服务流程

① 原始材料的澄清;

② 目的重组蛋白的捕获(GST、His标签蛋白);

③ 破碎含有蛋白质的细胞;

④ 蛋白质粗提，清除杂质:去除核酸、原生质体、不溶物或者洗涤包涵体等;

⑤ 变性、浓缩;

⑥ 纯化：离子交换层析、亲和柱层析(带标签的融合蛋白)、凝胶过滤等;

⑦ 精制均一的目的蛋白;

⑧ 蛋白质纯度鉴定;

⑨ 蛋白质含量测定。

2、 蛋白质纯化的方法

蛋白质纯化的现有方法范围很广，从19世纪简单沉淀到复杂层析和亲和技术。方法可被分成几种不同的类别，如根据蛋白质的特点，可以将蛋白质纯化方法分成明显不同但又相互关联的4组：表面特征、结构、净电荷和生物学特性。

①基于蛋白质表面特征的方法：表面特征包括电荷分布和可及性、疏水氨基酸残基链的表面分布以及在较少程度上蛋白质在某pH时的净电荷。该法主要依赖于溶解度的特性，通过对溶解蛋白质的溶剂进行各种处理，使蛋白质的溶解度发生变化，从而引起沉淀，获得含有大量可溶性目的蛋白提取物。在这组方法中还包括高度特异性的免疫亲和层析技术，使用直接抗蛋白质表面上一个表位的抗体从混合物中将目的蛋白分离出来。

②基于整个结构(大小和形状)的方法：利用蛋白质的大小和形态的分离主要采用凝胶过滤法。蛋白质大小的范围很大，从zui小的分子质量约5000 Da的蛋白质(被分类为蛋白质，而不是肽)到几百万道尔顿的大分子物。许多蛋白质在具有生物活性的状态下为寡聚体，由一个以上的多肽组成，这种寡聚体可以被解离。

③基于净电荷的方法：利用蛋白质全部净电荷的两种技术是离子交换层析和电泳。离。离子交换剂结合带电荷的分子，而且基本只有两种离子交换剂：阴离子和阳离子。，离子交换剂由固定化的带电基团组成，能够吸引带不同电荷的蛋白质，这些离子交换剂能够提供对天然蛋白质具有zui高分辨率的分离(图1)。

④基于生物学特性的方法(亲和法)：从其他蛋白质中分离目的蛋白的一种强有力的方法是使用生物特异性的方法。除了从理论上能够通过免疫亲和层析进行纯化蛋白质以外，亲和法只局限于具有某种特异结合特性的蛋白质，免疫亲和层析是所有亲和技术中zui特异的。在亲和层析技术中，将与蛋白质结合的配体(或能够与蛋白质结合的抗体)固定化，则能够选择性地吸附目的蛋白(图2)。

图1 离子交换原理 图2 亲和层析原理

3、 蛋白质纯化的原则

①确定zui终目的：确定zui终目的蛋白的纯度水平和所需要的量;

②建立一种快速的分析方法：该方法可监控目的蛋白的纯度，快速检测目的蛋白的活性和每一步骤中的回收率，分析也应能容易地处理大量样品;

③在预实验中确定目的蛋白的化学特性和物理特性:如pI、大小、温度稳定性和配基专一性等，以利于简化分离技术的选择和*化,可能的话，在每一纯化阶段采用不同的分离技术;

① 保持纯化操作尽可能简化：额外的步骤总会减少目的蛋白的产率，也会增加整个过程的时间;

② 每一步骤要处理尽量少的样品：避免冗长的操作，否则可能会减少产率，导致生物活性的丢失;

③ 在纯化操作的早期除去危险污染物，特别是蛋白酶;

④ 加稳定性添加剂要小心，如去污剂和盐，因为可能需要在以后的纯化步骤中除去这些添加剂，否则它们可能会干涉分析。

4、 材料要求

① 尽量选用新鲜的材料;

② 实验材料涉及危险品，loogene公司不予服务;

③ 提供尽量详细的实验背景材料;

④ 大规模生产时，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料;

⑤ 对预处理好的材料，若不立即进行实验， 应冷冻保存。

5、 实验周期

① 纯化1～5mg蛋白质，20个工作日

② 纯化5～10mg蛋白质，30个工作日

③ 纯化10mg蛋白质以上，40个工作日

6、 提供结果

完整的实验操作步骤、目的蛋白质纯度鉴定(85%，90%，95%)、目的蛋白质含量鉴定等。