在加热灭菌前，培养基(尤其是琼脂培养基)的成分应边搅拌边溶解于水中。

正如在2.3中所提到的，高压灭菌的时间取决于培养基中微生物的含量，容器的大 小，每个容器中物质的体积和灭菌锅内容器的空间。在制备培养基时，由于污染的微生物的含量通常很低，所以影响高压时间的主要变量取决于上述其他的几个因素。灭菌时间 通常要在121℃下保持15~20min,这个时间从中心温度达到121℃开始计算。可以将热 电偶放人灭菌锅内部中心进行测定。lOOmL的瓶子或烧杯单独放在髙压锅中达到121℃大约需要10min，如果多个瓶子紧挨着放满灭菌锅内的丝悬筐中，瓶子中的物质需要 20min才能达到121℃如果培养基或稀释液的体积很大时，则需要更长的时间；例如单 独使用1L的瓶子温度达到121℃时需要20min,如果许多这样的瓶子紧挨着放满灭菌锅 内的丝悬筐中，则中心温度要达到121℃需要30mm或更长的时间。很明显，为了达到灭 菌的目的，对培养基和稀释液进行高压灭菌时，惟一正确的方法是将热电偶放入灭菌锅中测定。

当培养基分装在大的容器(1L或更大时）中时，可能会因为延长灭菌加热时间而造成 热降解。因此在高压灭菌前，先将培养基成分溶解后分装到较小的容器中（如装入 100ml带螺帽的浅试剂瓶中)。