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上海源叶生物科技有限公司>技术文章>食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测

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食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测

阅读:1115          发布时间:2015-9-30

范围

本标准规定了食品中大肠菌群的快速检验和计数方法。

本标准适用于食品中大肠菌群的快速检验和计数。

规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的版本。凡是不注日期的引用文件,其版本适用于本标准。

GB 4 78 9.3 食品卫生微生物学检验大肠菌群测定

GB 4 78 9.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

ISO 4 83 2:1991(E) 微生物学— 大肠菌群菌落计数法通则

术语和定义

下 列 术 语和定义适用于本标准

3.1

大肠菌群coliform bacteria

大肠菌群是革兰氏阴性、无芽抱、氧化酶阴性的杆状细菌,为需氧和兼性厌氧,可在有胆盐(或具有其他抑制生长的表面活性剂)存在的情况下生长,通常可在36℃士2℃发酵乳糖并产酸和醛。具有件半乳糖昔酶。在本标准设定的条件下,大肠菌群为能分解R-半乳糖昔、使培养基发出荧光或生成紫色(或红色)菌落的一群革兰氏阴性无芽抱杆菌。

4 原理

4.1 zui可能数(MPN)法

大 肠 菌 群可产生各半乳糖昔酶,分解液体培养基中的酶底物—4一甲基伞形酮一各D一半乳糖普(以下简称MUGaD,使4一甲基伞形酮游离,因而,在波长366 nm的紫外光灯照射下呈现蓝色荧光。

4.2 平板法

大肠菌群可产生件半乳糖昔酶,分解培养基中的酶底物— 茜素一份D-半乳糖昔(以下简称Alizgal),使茜素游离并与固体培养基中的铝、钾、铁、钱离子结合形成紫色(或红色)的鳌合物,使菌落呈现相应的颜色。

试剂和培养

5.1 磷酸盐缓冲液

按 GB 4 789.28-1994中3.22规定进行制备。

5.2 生理盐水

5.2.1 成分

氯化钠 8.5g

蒸 馏 水 10 00m L

5.2.2 制法

将氯化钠溶于蒸馏水,121'C蒸汽灭菌15m in,

5.3 MUGal肉汤

5.3.1 成分

胰蛋白或胰酪20.0 g

氯化钠 5.0 g

无水磷酸氢二钾2.75 g

无水磷酸二氢钾2.75 g

月桂基硫酸钠0.1g

MU G .I (纯度不低于99%) 0. 08 g

蒸馏水 1000m L

5.3.2 制法

将各成分加热溶于蒸馏水中,以15% 20肠氢氧化钠溶液调整pH值,分装于20m mX 1 50m m试管,每管9 mL,116"C蒸汽灭菌10 min,zui终pH值7.0-7.2。待培养基冷却后,以无菌手续于每管培养液内加人0.1 m L经无菌水稀释的500p g/mL头抱磺徒液或于10 00m L灭菌培养液内加1m L经无菌水稀释的5 mg/mL头抱磺吮液并以无菌操作分装试管。

注 :双 料 MUGal肉汤除燕馏水外,其他成分加倍。

5.4 Aliz-gal琼脂

5.4.1 成分

胰蛋白或胰酪20.0 g

氯化钠 5.0 g

无水磷酸氢二钾2.75 g

无水磷酸二氢钾2.75 g

月桂基硫酸钠0.1g

Aliz-gal (纯度不低于97写) 0.05 g

异丙基硫代半乳糖昔0.03g

硫酸铝钾 0.5 g

柠檬酸铁钱0.5 g

琼脂 15.0 g

蒸馏水 1000m L

5.4.2 制法

将各成分放蒸馏水中,加热使溶化,以15%~ 2 0%NaOH调整pH值,分装烧瓶,1160C燕汽灭菌10m in,zui终pH值7.0-7.2 

6 设备和器材

培养箱:37℃士10℃

冷藏箱:0℃士4℃

天平:感量0.01 g

均质器或乳钵。

平皿:直径90 mm,

试管:20 mm ×150 mm.

吸管:1.0 ml一和10.0 ml。

广口瓶或三角瓶:容量500 ml

玻璃珠:直径约5 mm

试管架

紫外灯(波长366 nm)

其 他

7检验程序


8 样品的制备

8.1 以无菌手续取25 mL(或25 g)样品,加于含225 mL无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的广口瓶

(或三角瓶)内(瓶内预置适当数量的玻璃珠),充分振摇或用均质器以8000r/m-10000 r/m均质1 min成1:10稀释液。

8.2 用1m L无菌吸管吸取1,10样品稀释液1.0 m L,注人含9.0 m L无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的试管内,振摇均匀,即成1,10。样品稀释液。

8.3 另取1. 0 mL无菌吸管,按上法制备10倍递增样品稀释液。每递增一次,换一支1. 0 mL无菌吸管。

8.4 根据食品卫生标准要求或对样品污染程度的估计,选择三个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种三管培养基(MPN 法)或两个平皿(平板法)。

9 大肠菌群的MPN计数

9.1 将待检样品和样品稀释液接种MUGal肉汤管,每管1. 0 mL(接种量在1. 0 mL以上者,接种双料MUGal肉汤管)。每个样品接种三个连续稀释度,每个稀释度接种3管培养基。同时另取2支MUGal肉汤管(或双料MUGal肉汤管)加人与样品稀释液等量的上述无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)作空白对照。

9.2 将接种后的培养管置于3TC士1'C培养箱培养18 h-24 h

9.3 将培养管置于暗处,用波长366 nm的紫外光灯照射,如显蓝色荧光,为大肠菌群阳性管;如未显蓝色荧光,则为大肠菌群阴性管。

9.4 结果报告:根据大肠菌群阳性管数,查MPN表(见附录A),报告每100 m工(g)食品中大肠菌群MPN值。

10 大肠菌群的菌落计数

10.1 用灭菌吸管吸取待检样液1. 0 mL,加人无菌平皿内。每个样品接种三个连续稀释度,每个稀释度接种两个平皿。

10.2 于每个加样平皿内倾注巧mL45 C~ 50℃的Aiiz-gal琼脂,迅速轻轻转动平皿,使混合均匀。待琼脂凝固后,再倾注3 mL-5 mL Aliz-gal琼脂覆盖表面。同时将Aliz-gal琼脂倾人加有1 mL上述无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的无菌平皿内作空白对照。

10.3 待琼脂凝固后,翻转平板,于37℃士1'C培养箱培养18 h-24 h。取出平板,计数紫色(或红色)菌落。

10.4 结果报告

10-4.1 当平板上的紫色(或红色)菌落数不高于150个,且其中至少有一个平板紫色(或红色)菌落不少于15个时,按式(1)计算大肠菌群数:N=∑C/(n1+n2)d

式 中 :

N — 样品的大肠菌群数,个/mL或g;

∑C — 所有计数平板上,紫色(或红色)菌落数之总和;

n1 — 供计数的zui低稀释倍数的平板数;

n2 — 供计数的高一稀释倍数的平板数;

d— 供计数的样品zui低稀释度(如10-1,10-2,10-3等)

10.4.2 如接种所有(3个)稀释样品的平板上,紫色(或红色)菌落数均少于15个时,仍按式(1)计算,但应在所得结果旁加“‘"号,表示为估计值。

10.4.3 如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上,紫色(或红色)菌落数均少于15个时,报告结果为:每毫升(克)样品少于15个大肠菌群。

10.4.4 如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上,均未发现紫色(或红色)菌落数时,报告结果为:每毫升(克)样品少于1个大肠菌群。

10.4.5 如平板上的紫色(或红色)菌落数高于15个时,按式(1)计算,在结果旁加“,"号表示估计值或视情况重新选择较高的稀释倍数进行测定。


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