超声波提取马鞭草中黄酮类化合物的工艺研究

超声波提取马鞭草中黄酮类化合物的工艺研究

      
　　马鞭草Verbena officinalis L.又叫铁马鞭、自马鞭、疟马鞭，皆以穗类鞭鞘而得名。为马鞭草科（Verbenaceae）多年生草本植物马鞭草的全草或根。常生于河岸、草地、荒地、路边、田边及草坡等处，全国各地均有分布［1］。体内富含糖、淀粉、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质、黄酮、类胡萝卜素等许多活性成分［2］。药用部分为其全草或带根全草，作为一种传统的中草药，具有清热解毒、截疟杀虫、治痢、利水消肿、通经散瘀等功效，被广泛用于治疗伤风感冒、水肿、痢疾、黄疸等病症［3］。现代研究还发现马鞭草具有抗癌［4］、抗早孕［5］以及免疫调节作用［6］。
    
　　有文献报道马鞭草中黄酮类化合物的提取方法采用乙醇提取［2］， 但是，这种方法的提取效率仍然较低。近年来，超声技术应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等研究已有报道［7～9］，表明其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。很多研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响［10］。超声技术应用于提取马鞭草中黄酮类化合物的研究尚未见报道,本文报道用超声波提取马鞭草黄酮类化合物及鉴别。

　　1 材料

　　1.1 仪器  

　　UV-752紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；AL104 电子天平（Mettler-Toledo仪器公司）；KQ-500DE型医用超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；F120型粉碎机（北京中仪金叶科技有限公司）；pH213型酸度计（上海雷磁仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（郑州市亚荣仪器有限公司）。

　　1.2 试剂　

　　95%乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、三氯化铝、镁粉、正丁醇、氨水、盐酸、冰醋酸、乙酸镁、醋酸乙酯（均为AR）；芦丁标样（含量≥98%）由广东药学院药物化学研究室提供；马鞭草样品采于湖南省吉首大学校园内，并经湖南省药材公司李树胜执业药师鉴定为Verbena officinalis L.全草。

　　2 方法

　　2.1 黄酮类化合物成分提取　

　　取新鲜马鞭草，洗净，晾干，粉碎。精密称取马鞭草粉末10.0 g，加100 ml 95%乙醇，超声波提取2 h，抽滤。滤渣再加100 ml 95%乙醇，超声波提取2 h，抽滤，合并两次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩5～8 ml为止，放置100 ml容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，得待测样品溶液。

　　2.2 测定方法依据　

　　以芦丁为对照品测定马鞭草中黄酮类化合物的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。

　　3  结果

　　3.1  定量实验-黄酮类化合物的含量测定

　　3.1.1  波长的选择　

　　取样品溶液适量，在0.5 ml 5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液在400～700 nm波长范围测定螯合物的吸光度，螯合物于502 nm 波长处有zui大吸收，故测定时选用此波长。

　　3.1.2 标准曲线的绘制　

　　分别精密吸取芦丁对照液 （0.10mg/ml） 0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml于10.00 ml容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.50 ml，摇匀，静置5 min；再加10%硝酸铝溶液0.50 ml，摇匀，静置5 min；再加4%氢氧化钠溶液5.00 ml，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置15 min，以试剂作空白，于502 nm处测吸光度。结果见表1。根据表1得回归方程：A=-1.233 6×10-2+15.011C，r=0.999 8。表1  紫外可见分光光度计测定芦丁对照液吸光度值（略）

　　3.1.3 提取物含量的测定　

精密吸取样品液0.5 ml，置10 ml容量瓶，按标准曲线的制备操作测定吸光度A=0.615，根据回归方程：A=-1.233 6×10-2+15.011C，计算样品中黄酮类化合物的含量为8.36 mg/g。

　3.1.4 回收实验　

　　精密量取样品液1.0 ml，加入标准芦丁对照品1.0 ml （0.1 mg/ml），同“3.1.3”方法操作测定吸光度，求出平均回收率为99.56%。

　　3.2 定性实验-黄酮类化合物的鉴别

　　3.2.1 颜色反应　

　　乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1%乙酸镁（指质量浓度）的甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。

　　盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液2 ml于试管中加镁粉，再加入浓盐酸数滴（1次加入），在泡沫处呈紫红色。

　　三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1%三氯化铝（指质量浓度）的乙醇溶液，吹干，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。

　　浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏2.0 min，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。

　　紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。

　　3.2.2 纸层析　

　　取样品溶液15 μl点在滤纸上。用正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5 为展开剂，上行展开3.0 h，取出晾干。喷1%氯化铝的乙醇溶液，吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。

　　4 讨论

　　黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分，具有很高的药用价值。在自然界中zui常见的是黄酮和黄酮醇，其它衍生物还有黄烷醇、查尔酮、双氢黄（醇）、双黄酮、异黄酮、花色苷、橙酮及新黄酮类等［10］。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，进入脂肪组织，进而体现出诸多功能，如消除疲劳、保护血管、防止动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抵抗脂肪氧化、抗击衰老、活化大脑及其他脏器细胞等功能。此外，黄酮类化合物还具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用［11］。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然、低毒、绿色、可再生等特点备受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用已越来越引起人们的注目。我国马鞭草资源十分丰富，分布也极为广泛。本实验结果表明，马鞭草体内富含黄酮类化合物，采用超声波乙醇浸提法，可以达到省时、、节能的目的，提取效率高于传统方法，样品的平均回收率达99.56 %；而且利用该法提取、纯化得到的黄酮类化合物，其产率和纯度均很高；再者本方法采用全物理过程，无任何污染，因此是一条理想的提取黄酮类化合物途径，具有广阔的应用前景。

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