摘要:目的 建立快速测定人体血浆中克林霉素浓度的液相色谱2质谱测定法。方法 血浆样品以甲醇沉淀蛋白,
直接将上清液酸化后进行HPLC-MS 分析,色谱柱为Lichrospher C18柱(250 mm×4.6 mm ,5μm) ;流动相为40 mmol·L - 1乙酸铵缓
冲液(pH 4.1)-甲醇(30∶70 ,V/ V) ;内标为林可霉素;检测离子( m/ z) :425.2 (克林霉素[M + H] + ) 、407.3 (内标林可霉素[M +H] + ) 。
结果 血浆标准曲线线性范围为0.01007 mg·L - 1~10.07 mg·L - 1 ,高、中、低3 种浓度的批内和批间精密度均小于1010
% ,提取回收率为87.0 %~92.4 %。20 名健康受试者随机交叉口服受试制剂和参比制剂各300 mg 后,用HPLC2MS 法测定血浆
中克林霉素血药浓度,用面积法估算的受试制剂的相对生物利用度为(10013 ±1015) %。
结论 建立的HPLC2MS 分析方法快
速、灵敏、准确、简便,适用于临床药代动力学研究。
中图分类号 R927. 1 文献标识码 A 文章编号 10072306 (2006) 032159203
Rapid Determination of Clindamycin in Human Plasma by HPLC2MS
ZHANG Hong2xi1 ,LI Chun2ying2 ,Chen Guo2wei2 ,Ding Li2
1 Hunan Jianlang Pharmaceutical Industry Co1 , Ltd ( Yueyang 414000)
2 China Pharmaceutical University ( Nanjing 210009)
ABSTRACT:AIM To develop an HPLC2ESI2MS assay for the determination of clindamycin in human plasma. METHODS After be2
ing deproteinated by methanol ,plasma samples were separated by HPLC2MS on a reversed2phase C18 column with a phase of 40 mmol·
L - 1 ammonium acetate buffer solution (pH 411)2methanol (30∶70 ,V/ V) ,in which the target ions ( m/ z) were at 42512 for clindamycin and
40713 for the internal standard. RESULTS A good linearity was obtained from 0101 mg·L - 1~10107 mg·L - 1 of clindamycin with r =
019999. The RSD of within2day and between2day variation of the method were both less than 10 %. The recoveries of four concentration
0101007 ,011007 ,11007 ,10107 mg·L - 1 were 8710 %~9214 %. The randomized crossover trial was performed in 20 healthy volunteers using
the test capsules and reference capsules individually at a single 300 mg dose. Then blood samplings from the subjects were conducted for
HPLC2MS analysis and the relative bioavalability of the test capsules was (10013 ±1015) %. CONCLUSION The assay was proved to be
rapid ,sensitive ,accurate and convenient. It can be used to study pharmacokinetics of clindamycin.
KEY WORDS :Clindamycin ;HPLC2ESI2MS;Pharmacokinetics
严重感染。本实验建立了快速测定人体血浆中克林霉素浓度的液相色谱2质谱联用测定法。并将该法用于监测健康志愿者口服克林霉素受试制剂和参比制剂的血药浓度经时过程,估算受试制剂的相对生物利用度,同时为临床用药提供参考。
1 仪器与试药
1. 1 仪 器
Agilent 1100 液相色谱2质谱联用仪(美国Agilent公司) 。
1. 2 试药与试剂
克林霉素标准品(中国药品生物制品检定所,含·159 ·
江苏药学与临床研究 2006 年第14 卷第3 期
X [通讯作者] :025283271289
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量:8712 %) ;林可霉素标准品(内标,中国药品生物制品检定所,纯度:8514 %) ;盐酸克林霉素胶囊(受试制剂, 江苏亚邦爱普森药业有限公司, 批号:030608 ,规格:150 mg/ 粒) ;盐酸克林霉素胶囊(参比制剂,常州兰陵制药有限公司,批号:030620 ,规格:150 mg/ 粒) 。甲醇(色谱纯,Merck 公司) ;乙酸铵为分析纯;水为去离子纯净水。
2 实验方法
211 色谱与质谱条件
色谱柱:Lichrospher C18柱(250 mm ×416 mm ,5μm ,江苏淮阴汉邦科技有限公司) ;流相:40mmol·L - 1乙酸铵缓冲液(pH 411)2甲醇(30∶70 ,V/ V) ; 柱温:25 ℃;进样体积:40μl ;离子极性:正离子;离子
化方式:气动辅助电喷雾离子化;离子检测方式:选择性离子检测(SIM) ;检测离子( m/ z) :42512 (克林
霉素[M+ H] + ) 、40713 (内标,林可霉素[M + H] + ) ;传输区电压:110 V ;干燥气流量:10 L·min - 1 ;雾化室压力:276 kPa ;干燥气温度:350 ℃。212 标准溶液的配制克林霉素标准溶液的配制:精密称取克林霉素10107 mg ,置10 ml 量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得11007 g·L - 1克林霉素的储备液。取储备液1 ml 置10 ml 量瓶中,加入甲醇稀释至刻度,摇匀,即得10017 mg·L - 1克林霉素甲醇溶液;再依次稀释,定容配成10107 、11007、011007 mg·L - 1的克林霉素甲醇标准溶液。内标(林可霉素) 标准溶液的配制:首先精密称取内标10136 mg ,置10 ml 量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得11036 g·L - 1内标储备液。取储备液0120 ml 置50 ml 量瓶中,加入甲醇稀释至刻度,摇匀,即得41144 mg·L - 1的内标甲醇溶液。213 血浆样品处理精密吸取血浆样品012 ml ,置1 ml 离心管中,加41144 mg·L - 1内标溶液50μl ,涡旋10 s ,再加入甲醇017 ml ,涡旋3 min ,16000 r·min - 1离心5 min ,吸取
上清液015 ml 转移至另一1 ml 离心管中,加入100mmol·L - 1的乙酸铵缓冲液(pH 411) 70μl ,涡旋10 s
混匀,于16000 r·min - 1离心3 min ,吸取上清液,转移至自动进样器样品管中,进行LC2MS 分析,进样体
积40μl 。
214 试验方案
20 名男性健康受试者,体重59~66 kg ,身高164
~174 cm ,按体重指数BMI 为2119 ±011 ;年龄22~
32 岁。经体检证明肝、肾功能正常,心电图正常。
采用标准二阶段交叉设计自身对照试验法,按自身
交叉对照试验方案将受试者随机分为T、R 两组。
试验*阶段T 组口服受试品盐酸克林霉素胶囊
300mg ,R 组口服参比品盐酸克林霉素胶囊300 mg。
实验前2 周及实验期间未服用其它任何药物;实验
期间统一饮食。受试者于服药前及服药后10 、20 、
30 、45 min ,1、115、2、3、5、8、11 、14 h 采血3 ml 于肝素
化试管中,分离出血浆,于- 20 ℃保存待测。经1
周清洗期后,T、R 两组交换服药顺序进行第二阶段
试验。
3 结 果
311 色谱行为
在本实验条件下,克林霉素保留时间为518 min
左右;内标保留时间为315 min ,并无杂峰干扰测定,
见图1。
图1 不同样品的色谱图
A:空白血浆;B :加入克林霉素和内标标准品后的血浆;C:健康受试者口服盐酸克林霉素胶囊后的血浆(加内标)312 标准曲线的制备取离心管数支,分别精密加入不同量的克林霉·160 ·
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素标准液后以氮气流吹干,加入空白血浆012 ml ,涡
旋1 min ,配成含克林霉素分别为0101007、0103021、
011007、013021、11007、21014、51035、10107 mg·L- 1的
标准血浆,按“213”项下测定,记录色谱图,计算克林
霉素峰面积As 和内标峰面积Ai 的比值f ( f = As/
Ai) ,以f 值对血药浓度( C) 作权重回归计算, 得回
归方程:
f = 019069 ×C + 41838 ×10 - 4 (权重系数1/ C , r
= 019992) 。
按上述条件测得克林霉素在血浆中的zui低定量
限为0101007 mg·L - 1 (S/ N≈10) 。
313 精密度试验
取离心管数支,按“312”项下制备含克林霉素浓
度分别为0101007、011007、11007、10107 mg·L - 1的含
药血浆(每个浓度做5 份样品) 及一条随行标准曲
线,同“213”项下测定。每天做一批及一条随行标准
曲线,连续做3 天,共3 批,每批每个浓度做5 份样
品,以此计算批内和批间精密度。含克林霉素分别
为0101007、011007、11007、10107 mg·L - 14 种浓度的
批内精密度分别为:4159 %、2176 %、2134 %、1103 %;
其批间精密度分别为: 6110 %、4162 %、3142 %、
2109 %。
314 提取回收率测定
考察了含克林霉素为0101007、011007、11007、10107 mg·L - 1 4 种浓度的标准血浆提取回收率,结 果分别为87101 % ±4156 %、87152 % ±3197 %、91161 % ±2173 %、92144 % ±1144 %( n = 5) 。315 准确度试验(方法回收率)考察了含克林霉素为0101007、011007、11007、10107 mg·L -1 4 种浓度的标准血浆方法回收率,结果分别为10513 % ±5150 %、92174 % ±2160 %、98194 % ±2124 %、10011 % ±0157 %( n = 5) 。316 稳定性试验在0101007、011007、11007、10107 mg·L - 1 4 种浓度水平考察含克林霉素标准血浆的稳定性,结果显示克林霉素血浆分别在室温放置8 h、反复冻融、-20 ℃冰箱中冷冻保存3 周的条件下均稳定。317 药动学研究本实验采用中国药科大学药代中心杨劲编写的Bapp210 软件,估算药代动力学参数以及进行生物等效性的评价,对两种制剂的参数AUC02τ、Cmax进行自然对数转换后先用双交叉实验设计的方差分析,再用双向单侧t 检验进行生物等效性评价; 参数tmax采用非参数法(Wilcoxon 符号秩检验) 进行统计。20 名健康受试者分别口服参比和受试两种制剂各300 mg ,用HPLC2MS 法测定血浆中克林霉素浓度,用面积法估算受试制剂的相对生物利用度为(10013 ±1015) %。其平均血药浓度2时间曲线见图2。
图2 20 名受试者分别口服参比和受试两制剂300 mg 后的克林霉素的平均血药浓度2时间曲线
—● —参比; —□ —受试
20 名健康受试者口服受试制剂估算的克林霉素的AUC0214为17102 ±3193μ__________g·h - 1·ml - 1 ,消除半衰期为217 ±015 h ,达峰时间和达峰浓度分别为017 ±012 h 和4158 ±1110 mg·L - 1 ;口服参比制剂估算的克林霉素的AUC0214为17122 ±4176μg·h - 1·ml - 1 ,消除半衰期为218 ±016 h ,达峰时间和达峰浓度分别为018 ±013 h 和4169 ±1119 mg·L - 1 ,两种盐酸克林霉素胶囊制剂的药代动力学参数相近。
4 讨 论
在血浆样品的处理过程中,文献[1 ]采用有机溶剂提取法提取血浆中的克林霉素;文献[2 ]采用固相萃取小柱萃取法提取血浆中的克林霉素,操作繁琐费时。本实验采用甲醇直接沉淀血浆中的蛋白,所需血浆样品量小,经涡旋和离心后取上清液酸化进行HPLC2MS 分析测定,前处理过程操作简便,在处理大批量血浆样品时可大大减少工作量和节省时间。此外,实验中发现,若血浆样品经甲醇沉淀蛋白后直接进HPLC2MS 分析,则克林霉素和内标峰形均不佳且响应较低。在上清液中加入乙酸铵缓冲溶液后,克林霉素和内标峰形尖锐且响应增大。本方法简便、快速、准确,可用于克林霉素的血药浓度测定和临床药代动力学研究。