二硫键上的定点修饰

 

    很多蛋白质中半胱氨酸都是以二硫键的形式存在，将二硫键还原为两个游离的巯基，再用双反应性的聚乙二醇化试剂进行修饰，可形成一种三碳桥结构（如图），能替代二硫键起稳定修饰产物空间结构的作用，对活性影响很小。用该方法修饰干扰素 α-2b（IFN）时，发现修饰产物 PEG-IFN 的生物活性与 PEG 的长度无关，比其他位点的聚乙二醇修饰收率高，成本低。抗原结合片段（Fab）在血液循环中迅速消除，是聚乙二醇化修饰的良好对象。Khalili 等合成了PEG-双砜试剂，能特异性地将二硫键末梢定位到 Fab 的结合区。对贝伐珠单抗、雷珠单抗、曲妥珠单抗等水解得到的 Fab 进行 PEG 化，离子交换色谱纯化后得到纯的 PEG-Fab 产品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）未检测到 PEG 损失。用表面等离子体共振（SPR）进行比较结果研究表明：（1）Fab 和用于定点聚乙二醇修饰的 PEG 双烷基化试剂匹配良好；（2）PEG-Fab 只在表面亲和力下降了 2 倍，而解离速率没有任何变化；（3） PEG 相对分子质量变化时，表面结合速率和亲和力保持不变。

 

单点突变引入巯基后的修饰

 

    何燕等将比伐卢定（BVLD）多肽链 7-甘氨酸（Gly）用半胱氨酸（Cys）取代，用聚乙二醇定点修饰巯基，采用多肽固相合成法制得 [Cys]7-BVLD，其与不同相对分子质量的 mPEG-MAL 偶联合成了 3 个聚乙二醇化比伐卢定衍生物：[Cys(mPEG2000-MAL)]7-BVLD、[Cys(mPEG 5000-MAL)]7-BVLD和[Cys(mPEG10000-MAL)]7-BVLD，这些衍生物的结构经 MS 确证。凝血酶原时间和凝血酶时间评价结果表明，3 个衍生物均表现出良好的抗凝活性，尤其是[Cys(mPEG5000-MAL)]7-BVLD 的抗凝活性优于比伐卢定。

    安群星等选择天花粉蛋白（TCS）分子上可能的抗原决定簇位点 KR173-174 进行定点突变，并将所构建的突变体 TCS KR173-174 在大肠杆菌中表达及纯化。通过该突变体第 173 位引入的半胱氨酸残基进行 PEG 定点修饰。结果表明，所构建的突变型 TCS（mTCS）的活性与野生型 TCS（wTCS）活性相当，而免疫原性已显著降低。PEG 修饰型 TCS 虽活性稍低，但其免疫原性、急性毒性以及药动学性质得到显著提升。表明通过基因工程及化学修饰方法改造 TCS 可行，所构建的突变型及 PEG 修饰型 TCS 值得进一步研究。

    黄湘鹭等利用蛋白质分子同源模建，选择在集成干扰素分子 IIFN 的第 72 位引入半胱氨酸残基构成集成干扰素突变体 IIFN72C。诱导表达后经包涵体变复性和柱色谱纯化，与 mPEG-MAL 定点偶联。结果表明，IIFN72C 以包涵体形式表达，表达量占菌体总蛋白的 30%以上，比活性与突变前相当，修饰产物大多数为单修饰体，纯化后质量分数大于98%，比活性保留约为修饰前的 8%。

   治疗严重痛风的一种方法是注射非人类尿激酶，以减少体内尿酸水平。pegloticase 是一种聚乙二醇化的猪–狒狒嵌合尿激酶，用于慢性难治性痛风，但会产生较多的过敏反应，此外，还有一些皮肤红肿、便秘、胸痛和呕吐等副反应，这些限制了它的应用和效果。Nyborg 等^[16]研制了一种治疗性的尿激酶，在 200 个代表不同 HLA 单体的人体样本中，免疫原性较低，将半胱氨酸设计到该序列中，用聚乙二醇定点修饰，效率能达到 95%。聚乙二醇尿激酶在体外，中性 pH 值条件下，在人体血浆中以及鼠类和犬类体内的酶活性保持不变。在犬身上，皮下注射能使血浆中尿酸水平降低 85%。这种聚乙二醇化的非免疫原性尿激酶将为痛风患者带来极大的帮助。

    葡激酶（SAK）是一种细菌来源的、具有良好靶向性和溶栓活性的蛋白，拥有极大应用潜力，但在生物体内产生严重免疫反应，血浆半衰期短（仅3min）。根据 SAK 晶体结构及抗原位点选择突变位点，构建突变质粒，并在大肠杆菌中表达半胱氨酸（Cys）突变蛋白 S-cys；对目的蛋白在不同条件下进行聚乙二醇修饰^[17]，纯化后得到较高纯度的修饰蛋白 PEG-S-cys，通过纤维蛋白平板溶圈实验和动物栓塞模型的构建初步对其生物活性进行验证。结果表明所得 PEG-S-cys 蛋白质量分数大于 90%， PEG-S-cys 具有溶栓活性，这为葡激酶的改造提供了一种新的方法与思路。

 

多点突变引入巯基后的修饰

 

    梁凌宇等采用分子生物学技术经点突破得到rhCNTF 突变体 CN10，运用 mPEG-MAL 对 CN10进行定点修饰，每 2 天 ip 一次 PEG 化的 CN10，对小鼠体质量的增长抑制率可达 50%，与每天注射 2次rhCNTF 的体质量增长抑制作用相当，说明 CN10蛋白在 PEG 化修饰后，其减重效应持续时间可明显延长。冯翠等则采用 mPEG-MAL 对 rhCNTF 的第 17 位半胱氨酸巯基进行定点修饰，实验结果表明，在 pH 7.5 的 Tris-HCl 缓冲溶液中，蛋白质与修饰剂的比例为 1∶3，4 ℃下反应 12 h，修饰率可达到90%以上，修饰混合物通过一步阴离子交换色谱可获得质量分数 98%以上的单修饰产物。荧光光谱和圆二色图谱显示 mPEG-CNTF-C17 与原蛋白二、三级结构一致。细胞增殖活性检测表明，mPEG-CNTF-C17 的比活达到了 6.51×10⁵ IU/mg，体内循环半衰期相对原蛋白提高了 30.3 倍。该研究为开发 CNTF 长效产品提供了基础。

    为获得高抗菌活性聚乙二醇定点修饰的溶葡萄球菌酶（Lysn），根据该酶的结构，在它的催化域和结合域上优选 8 个位点（Q9、N13、N40、T172、N174、G197、V240 和 T244），分别突变成半胱氨酸，纯化后的溶葡萄球菌酶突变体经二硫苏糖醇（DTT）处理后与 mPEG-MAL 进行定点修饰反应，RP-HPLC 分析显示 PEG 修饰率大于 70%，修饰产物经 MacroCapSP 阳离子交换层析纯化后，PEG 化溶葡萄球菌酶的质量分数大于 95%。比浊法和小抑菌浓度（MIC）实验表明 20K-PEG-LysnV240C和20K-PEG-LysnT244C 的抗菌活性维持在原来的50%左右。研究结果为溶葡萄球菌酶全身给药治疗金黄色葡萄球菌感染奠定了基础。

 

通过 Traut 试剂引入巯基后的修饰

 

    为了构建 trastuzumab（TMAB）–聚乙二醇–PARAM 靶向递药系统，马鹏凯等以双功能聚乙二醇为连接子，并在 trastuzumab 上通过 Traut 试剂引入巯基。通过琥珀酸酐共价连接在 PAMAM 表面，由于酯键比较稳定，药物缓慢释放；随后再在PAMAM 表面共价结合双功能聚乙二醇 NHS-PEG-MAL，延长其在血液循环的时间，增强 EPR 效应，提高药物在肿瘤部位的浓度，后 PEG 末端连接巯基化的 TMAB，利用与 HER2 受体的作用提高进入肿瘤细胞的药物浓度，达到持续、有效、安全的肿瘤治疗策略。