通过ALPHA surefire ultra技术进行定量的细胞水平磷酸化检测-技术文章-珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司

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通过ALPHA surefire ultra技术进行定量的细胞水平磷酸化检测

阅读：353 发布时间：2020/4/29

　　小胶质细胞是髓系细胞，在介导中枢神经系统 (CNS) 中的炎性反应方面起重要作用。在其他任务中，小胶质细胞负责识别和消除外来入侵者，并修复由损伤引起的局部 CNS 组织损害。小胶质细胞受体-接头蛋白复合体 [称为骨髓细胞 2 表达的触发受体 (TREM2) 和 12 kDa DNAX 激活蛋白 (DAP12)] 的功能经证实在 AD 和帕金森病等多种神经退行性疾病中非常重要。TREM2 和 DAP12 之间的相互作用很可能介导与吞噬和碎片清除、促炎性细胞因子产生和释放的调节，以及促进小胶质细胞增殖和存活的转录变化有关的多种神经炎性反应。因此，TREM2/DAP12 功能变化直接影响小胶质细胞激活的时间和程度，从而影响神经元功能和存活。

　　TREM2 是一种跨膜糖蛋白，由胞外免疫球蛋白样结构域、跨膜结构域和胞质部分，其中胞质部分与 DAP12 结合，起到信号转导功能。TREM2 有来自病原体的外源配体，还有暂时尚未明确的内源配体。胞外配体结合会激活 TREM2，这反过来会激活 DAP12，从而导致胞内信号转导事件发生级联反应。具体而言，DAP12 包含一个基于免疫受体酪氨酸的激活基序 (ITAM)，其中酪氨酸残基在 TREM2 结合配体时会被磷酸化。然后这会募集 Syk 激酶来激活下游信号转导分子。

　　本文采用了 TREM2-/- 的小鼠对 TREM2 在脂质代谢以及 TREM2 缺失引起的小胶质细胞的胆固醇堆积的来源进行了探讨。发现TREM2在小胶质细胞脂质代谢过程中的重要作用以及myelin是胆固醇堆积的重要来源。TREM2 正常表达的动物和细胞在 TREM2 收到激活后，可以引起 DAP12 的自磷酸化，进一步招募 SYK 蛋白并将其磷酸化，激活 SYK 信号通路，激活下游的 DAM 和脂类代谢的基因，从而将小胶纸细胞吞噬的 myelin 胆固醇正常代谢为自由化的胆固醇。本文前期的大量的细胞实验和动物实验都验证了 TREM2 的功能，同时也构建了SYK的磷酸化检测平台，通过 ALPHA surefire ultra 的技术对 SYK 的磷酸化水平进行定量分析。

　　ALPHA surefire ultra技术是珀金埃尔默公司基于ALPHA平台开发出的细胞磷酸化检测工具。新的 AlphaLISA Surefire Ultra 采用成熟的 CaptSureTM 技术代替 Protein A，不仅实现了试剂盒抗体捕获的特异性，而且具有更低的检测背景。新的试剂盒利用 AlphaLISA 受体微珠代替 AlphaScreen 受体微珠，对血红蛋白淬灭干扰具有更加出色的光谱特性。ALPHA 检测本身非常简单。

　　ALPHA surefire Ultra 平台的特点：

　　步骤简单，减少时间和人工

　　细胞样本经过刺激、裂解后，只需要将试剂组分加入裂解液，无需任何多余的洗涤步骤。

　　高灵敏度及定量化检测

　　检测灵敏度大于等于 Western Blot 方法；可以检测过表达蛋白靶点及内源水平表达的蛋白；可以使用稳定表达细胞系或原代细胞及干细胞进行试验。

　　高Z'值和信号窗口

　　可以获得更高的信噪比、更低的cv以及更稳定的assay。

　　通量高的同时上样量少

　　可以兼容 96、384 或 1536 孔板的不同检测模式，适合于微孔板样品，样品只需 5uL 或以下的体积。

　　本文中将 TREM2 和 DAP12 共同表达在 293T 细胞中共同表达，以此为平台使用不同的脂类和蛋白类物质进行刺激，然后检测其 Syk 的磷酸化水平的变化。

　　珀金埃尔默同时提供Phospho-Syk (Tyr352)和total Syk检测试剂盒。

　　同时 ALPHA 新的技术也支持磷酸化蛋白和总蛋白同时检测：

　　Phospho-Syk (Tyr352)和total Syk检测试剂盒

　　长按识别下方二维码，获取详细产品信息

　　Phospho-Syk (Tyr352)

　　total Syk

　　另外还有Syk的下游激活的PI3K、ERK、NFκB等信号通路，根据具体环境，这些信号转导级联可差异性和协同性参与，从而影响各种小胶质细胞功能，包括受体介导的吞噬、β-catenin 和 mTOR 复合体 1 介导的转录调控、通过 PIP 2/3 介导的 AKT 和 mTOR 复合体 2 激活实现的代谢平衡、导致促炎性分子转录调控的 RAS/MEK/ERK 激活，以及导致肌动蛋白重构的钙调节。除了这些信号通路以外神经退行性疾病也会导致 Tau 蛋白等的磷酸化水平发生变化。这些变化都可以通过 ALPHA surefire ultra 的平台进行定量检测。

　　同时珀金埃尔默公司还提供高品质的 ALPHA Assay 检测设备：