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快速高效判断病毒活性,何惧“疫”军突起

阅读:445        发布时间:2020/2/13
  农历庚子年春节,“疫”军突起,新型冠状病毒(2019-nCoV)肆虐,全国上下正在面临一场疫情阻击战。医务工作者日以继夜救治病患,科研人员加班加点投入到抗击新冠病毒的相关研究中。
 
  在病毒学研究中,病毒空斑实验(virus plaque assay)将各稀释度的病毒液接种到单层细胞培养环境中,吸附2小时后,在单层细胞上覆以琼脂糖,病毒感染细胞并在细胞中增殖,使细胞破裂死亡。由于固体介质的限制,释放的病毒只能由初感染的细胞向四周扩展。经过几个增殖周期,便形成一个局限性病变细胞区,即病毒空斑。理论上,当病毒液充分稀释后,获得的每个空斑均源于初感染细胞的一个病毒颗粒。空斑实验是病毒滴定,筛选病毒突变株,检测病毒抗体和抗病毒的药物研究的常规手段。区别于传统的只检测病毒颗粒的PCR和免疫荧光方法,病毒空斑实验检测有活性的感染性病毒颗粒,即空斑形成数(PFU)。
 
  目前,病毒空斑实验主要还是通过人工计数的方式在6孔,12孔或24孔板里实现。这样的操作速度慢,主观因素大,出错率高;尤其当病毒活性比较高时,很难准确统计出空斑数。
 
  相比之下,利用成像配合自动计数的方法可以提高病毒空斑的检测通量,提升计数的准确性。如下图所示,用AlexaFluor™ 488染色的病毒进行空斑实验,在病毒空斑形成后通过明场成像和荧光成像,可以看到感染后病毒引起宿主细胞的结构改变,也称为细胞病变效应(CPE)。这类效应可能是或者细胞裂解导致单层(溶斑)出现孔洞(A),也可能是形态改变如细胞脱离(非溶斑)(B)。
 
  利用模块化的分析算法,计算机可以非常准确地判断出这两种细胞病变状态。如图C中,红色标注的是溶斑空洞,而蓝色的则是非溶斑的细胞脱离。
 
  为了验证计算机分析的准确性,研究人员进行了人工计数和计算机分析的比对实验。将病毒按不同倍数进行稀释,进行空斑实验。实验完成后,由3名分析人员进行人工计数,同时利用EnSight™多模式检测仪进行成像和空斑计数分析(下图)。
 
  实验结果显示:人工计数和自动图像分析都具有非常好的线性回归,其R2值非常相似。但是当病毒稀释倍数很低(病毒浓度高)的时候,人工计数就很难实现了 ,如下图中的1:20和1:10两个病毒浓度点(图D)。
 
  从空斑计数结果看(图E),第一次实验在人工可计数的病毒浓度下,计算机分析和人工计数值基本一值;但第二次实验中,在1:160和1:640两个病毒浓度下,2号分析人员明显高估了空斑的个数。这也说明人工计数存在一定的主观性,具有计数值偏离真实值的风险。
 
  以上实验是使用珀金埃尔默的EnSight™多模式检测系统完成的。结果表明成像自动分析可以显著提升病毒空斑实验的通量以及实验结果的准确性和稳定性。
 
  珀金埃尔默公司的EnSight™多模式检测仪是一款集传统酶标技术和高速微孔成像于一体的系统。EnSight™成像模块专为高速高效的细胞成像而设计,采用sCMOS相机以降低信号背景噪音,激光自动聚焦以快速成像,固态光源 (LED) 以进行短时照明;配备高内涵(HCS)图像分析内核的软件Kaleido™,使图像数据准确地转化成数字信息。同时,EnSight™的Alpha和TR-FRET等模块,可以在成像的同时检测同一样品中其他生化指标,让研究变得多维度,让科研人员对实验结果有更好的把握。
 
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