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一种简单的微环DNA制备与纯化方法
阅读：1573 发布时间：2023/11/30
宫颈癌(CC)是全世界妇女中常见的癌症之一，由人乳头瘤病毒(HPV)，也就是其毒性强的高危基因型HPV-16和HPV-18引起。持续感染后，HPV16/18编码E6和E7肿瘤蛋白，分别负责抑制和降解p53和pRB肿瘤抑制蛋白。
过去几年人类一直在探索基因疗法用于治疗此类不治之症。Minicircular DNA(mcDNA)由于没有原核序列，能很大程度的减少质粒转染后原核元件对转染效果和基因组的影响，因此被认为是一种很有前途的载体。然而，其实现的生物技术过程涉及很多步骤，这对制药行业来说就会比较昂贵。
为了简化步骤，使mcDNA的制备方法更加简单可行，贝拉大学健康科学研究中心、快速和可持续产品开发中心和赛多利斯公司联合开发了一种新的制备方法，该方法使用Sartoclear Dynamics® Lab(硅藻土与负压滤器组合套装)直接过滤并去除所有细胞碎片和沉淀的杂质，并结合使用膜层析柱Sartobind Q75 进行纯化作为第二步以去除 RNA。
结果
1 用Sartoclear Dynamics® Lab处理粗裂解液的结果比较
这种方法仅需的一个过滤步骤就可快速获得澄清的裂解物，而不是像传统方法那样使用有机溶剂和高盐并进行三个离心的繁琐过程。
2 使用Sartobind® Q75膜(季铵配体)进行纯化(季铵盐配体)
用10mM Tris，0.1M EDTA，pH8.0(基础缓冲液)进行平衡；加载 30 mL用DE处理的裂解液。
大多数RNA杂质在上样步骤中被直接去除，通过增加NaCl离子强度，最终获得了分离的DNA。
结论
• 使用Sartoclear Dynamics® Lab用硅藻土和过滤处理裂解物，与传统方法相比，可以节省大量时间、资源和环境影响
• 在对平衡和洗脱条件进行一些初步研究后，Sartobind Q75层析膜可以成功去除RNA杂质并分离纯度高于90%的DNA
• 可继续进行一些研究以获得分离的mcDNA载体并获得最大产量
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-本文摘自-
New Combined Approach to Simplify the Minicircular DNA Lysate and Directly Apply in Ion Exchange Membrane Chromatography
Mater. Proc. 2022, 8(1), 41;
Published: 24 May 2022