荧光定量检测试剂

荧光定量检测试剂【用法与判定】

1用法

1.1样品处理及模板准备

1.1.1样品处理

·组织样品处理：分别从猪肉组织、淋巴结、脾脏不同位置取样，用手术剪剪碎混匀后取0.1g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml无菌离心管，12000 r/min离心2分钟，取上清200μl备用。

·血液样品无需处理，取200μl备用。

1.1.2模板准备

·根据不同的样本类型，按照下表准备相应的样本用量。

·将样本加入到1.5 ml离心管中，加入下表*体积的Solution A，涡旋震荡20 s，并按照下表*的处理方法，室温静置3-5 min，或95℃金属浴振荡孵育3-5 min。

·样本充分裂解后（95℃金属浴振荡孵育的样本需恢复室温），加入下表*体积的Solution B，并涡旋震荡30 s，12000rpm离心2min，上清即为模板DNA。

·处理后的样本如在2小时内进行下一步试验，请于4℃保存，如不能立即进行下一步试验，请于-20℃保存。

备注：组织样本加入10倍体积的生理盐水制成组织匀浆液后，可按照血液样本的处理方法进行处理。

1.1.3可利用商品化试剂盒提取核酸进行反应，效果更佳

1.2荧光PCR扩增

1.2.1试剂准备

实验前20分钟将试剂从冰箱取出并恢复至室温，使其*融化，充分混匀后瞬时离心去除管壁吸附液体。

1.2.2配制反应体系

按下表1体系，在配套PCR管中配制反应体系，盖紧管盖后瞬时离心10秒，转移至扩增区。

表1 PCR反应体系

1.2.3 PCR扩增

快速模式

表2仪器PCR扩增参数

2判定

2.1合理调整阈值线，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。

2.2试剂盒有效性判定

·阴性对照：无Ct值，线形为直线或微斜，无明显指数增长。

·阳性对照：Ct值≤30，有明显指数增长，呈典型的S型曲线。

2.3样本结果判定

·样本检测结果Ct值≤38，有明显指数增长，判定为阳性，表明样本中检测出非洲猪瘟病毒。

·样本检测结果38＜Ct≤40，判定为可疑。应对样本进行复测，若复测结果Ct值仍在38~40之间，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。

·样本检测结果无Ct值，判定为阴性，表明样本中未检测出非洲猪瘟病毒。

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