（一）蛋白质的分离
利用5％～20％梯度的SDS-PAGE、尿素—PAGE、等电点聚焦（1EF）—PAGE、双向凝胶或琼脂糖凝胶作为介质，对蛋白质样品进行分离，其基本操作与凝胶电泳一样。不同之处是，凝胶厚度需0．8mm，经分离后的凝胶（SDS-PAGE除外）要浸泡在含SDS的缓冲液中，使蛋白质带上负电荷，以利于凝胶中的蛋白质在电场中转移到正极边的NC膜上。因此，在分离蛋白质时，大多数是用SDS-PAGE系统进行的。不过，也有用非SDS-PAGE系统替代的，如用此系统进行转移操作时，则需将凝胶上的蛋白质转移到处于正极和负的两张NC膜上（即将凝胶置两张NC膜之间），该程序的灵敏度较低。

（二）NC膜的处理
取一张与凝胶条大小相等的NC纸（用手术刀切），浸泡在电泳转移的缓冲液（一般为25mmol／L Tris，191mmol／L甘氨酸，20％甲醇）中0．5h（国产NC纸浸泡2h以上）。

（三）凝胶的处理
样品在SDS-PAGE中电泳后，切下欲转移的凝胶条区段或将整个凝胶板浸泡在电泳转移缓冲液中0．5h，轻轻摇动除去胶中的SDS、巯基乙醇等物质，使凝胶中的离子强度与转移液相同，以利于蛋白质恢复其天然结构和生物学活性，防止凝胶的膨胀。

（四）准备海绵和滤纸
剪裁与NC膜大小相同的海绵和滤纸各两块，用电极缓冲液浸湿。

（五）“夹心饼”的制作
先把有孔洞的有机玻璃板放在干净的玻璃板上，然后盖上一块海绵，海绵上铺一层滤纸，接着小心地把凝胶平放在滤纸上，NC膜要端端正正地放在胶面上（一旦放下就勿拿起）。在NC膜上依次盖上滤纸、海绵和有孔洞的有机玻璃板。zui后用橡皮筋捆紧，放入装有电极缓冲液的电场中。夹有凝胶的一端朝负极，夹有NC膜的一端朝正极。通电后调节电流为60mA左右（恒流），4℃环境下电泳6—18h。在制作“夹心饼”时，每两层之间不能有气泡，否则影响样品的转移。此外，电极液中应含有20％的甲醇，以防电泳过程中凝胶变形。分子质量大转移时间长，反之则时间短。通常转移过程也是进一步除去SDS和恢复转移物质的结构与生物活性的过程。

（六）鉴定
1．酶联免疫吸附测定法（ELISA） （1）试剂：①PBS液，含0．15mol／LNaCl的0．025mol／L磷酸盐缓冲液，pH7．4；②PBS-T液，含0．3％吐温的PBS液（淬灭剂）；③HBP-IgG溶液，HRP-人抗体复合物溶液；④联苯茴香胺溶液，50mg联苯茴香胺溶于10ml甲醇中；⑤染色液（用前配制），取27ml bPBS-T液，3ml联苯茴香胺液，35ul3％过氧化氢溶液混匀。
（2）染色：印迹后的NC膜在50～200mlPBS液中漂洗5min，除去粘在NC膜上的凝胶，而后在PBS-T或PBS-BSA（含3％的牛血清清蛋白的PBS）溶液中，37℃环境下，手摇振荡15min（封阻反应），与酶标记物溶液20ml（1；25，稀释度视HRP活力高低而定）反应2h（37℃环境下），再用PBS、PBS-T或PBS-BSA分别漂洗。接着转入30ml（如膜为4cmX8cm时）染色液浸泡5min左右，即可显出特异的抗原棕色谱带（注意：一旦谱带显示立即取出），用蒸馏水漂洗后，密封保存于4℃的蒸馏水中。
2．放射自显影术 封阻后的NC纸与放射性核素标记的抗体或其他相应的配体进行反应，接着经过漂洗、烘干、压片和冲洗，即可呈现自显影谱带。
除上述鉴定方法以外，使用印度墨水、天津绘图墨水、氨基黑和考马斯亮蓝等试剂也可进行染色，以鉴定印迹在NC膜上的蛋白质谱带。