色谱介绍

（ion pairreversed phase chromatography ）

色谱应用

反相离子对色谱法测定鱼腥草素钠的含量

仪器与试药

1.1 仪器 美国HPll00高效液相色谱仪，VWD紫外一可见光检测器，HPl 100化学工作站，Rheodyne手动进样器，日本岛津UV-265FW自动记录分光光度计，SB3200超声波清洗器。

1.2 试剂 乙腈、甲醇均为色谱纯，磷酸、醋酸、醋酸铵、四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵均为分析纯，超纯水。

1.3 对照品与样品 鱼腥草素钠对照品（中国药品生物制品检定所，批号为:0247-9601）;鱼腥草素钠原料（上海汉殷药业有限公司，批号为:990701，010301，030101，030301、040101）

2 测定方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Zorbax Cs 5μm，150 mn×4。6 mm;流动相:2mmol/L四丁基氢氧化铵溶液.乙腈（64:36）;流速:1。0mL/min;检测波长:283 nm;柱温为室温;进样量为20 μL。

2.2 色谱条件选择

2.2.1 检测波长及溶剂选择 取鱼腥草素钠对照品，用流动相超声溶解并制成约8μg/mL的溶液，进行紫外扫描。鱼腥草素钠能溶解并在283 nm处有最大吸收，故以此波长为检测波长，流动相为溶剂。

2.2.2 柱温选择 取同一样品溶液，于同日分别在室温（22℃）、柱温为42℃下各进样两针，结果鱼腥草素钠的理论塔板数依次为8 898、8 900、8 899、8 899，RSD为O.1%;峰面积依次为168 685、167 633、164 638、167 185，RSD为1.0%。说明柱效几乎不变，柱温对检测无影响，为避免加温对色谱柱的损害，所以采用室温作柱温。

2。3 供试品溶液的制备

取干燥至恒重的鱼腥草素钠适量，精密称定，加流动相超声溶解并稀释成含鱼腥草素钠约为24 μg/mL的溶液，摇匀，即得。另取鱼腥草素钠对照品，同法制备对照品溶液。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系考察 取鱼腥草素钠对照品，用流动相溶解并稀释制成每1 mL含鱼腥草素钠O.080 1 mg的溶液，即为储备液，精密取储备液o.5，1.0，1.5，2.0，3.0，5.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀即得。吸取上述储备液及稀释溶液各20μL注入液相色谱仪，依法测定，每个浓度重复进样2次，记录峰面积。分别以浓度C为横坐标，峰面积A的平均值为纵坐标，求得鱼腥草素钠的线性回归方程:A=1.289 5×10-2C+1.634 2×10-4，r=O。999 9;线性范围为:80.1-1 602μg/mL。

2.4.2 精密度试验 精密吸取鱼腥草素钠对照品溶液，注入液相色谱仪，记录峰面积，RSD值为1.O%（几=6）。

2.4.3 稳定性试验 取同一样品溶液于o，6，20，36，42，66h测定，记录峰面积，鱼腥草素钠峰面积6次测定值的RSD为0.9%，表明样品溶液在66 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一批样品（030301）3份，依法测

定，平均含量为100。6%，RSD为1.3%。

2.4.5 加样回收率试验 取已知含量的供试品5份，递增添加鱼腥草素钠对照品溶液适量，依法制备和测定。鱼腥草素钠的平均回收率为99.6%，其RSD为1.0%。结果见表1。

3 样品测定

取鱼腥草素钠原料5批，依法制备供试品溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液进样，用面积外标法计算，并用碘量法测定进行比对，结果见表2。

4 讨论

4.1 检测方法的选择 鱼腥草素钠易溶于热水，在水或乙醇中微溶，极性与对乙酰氨基酚相似，用其滴剂的反相检测方法，以C18（5 I.Lm，4.6mm×150mill）为固定相，不同比例的甲醇.醋酸与醋酸铵缓冲液（pH6。o）为流动相检测，均无峰检出。再将流动相改为不同配比的磷酸.水.甲醇，三乙胺.水.甲醇试验，仍未果。

参考了青霉素的反相离子对色谱法检测后，采用反相离子对色谱法，用短链固定相，C8（5 I.Lm，4.6 mm×150 mm）色谱柱，在流动相中加入反离子试剂四丁基溴化铵，有峰检出，但分离效果差;改加四丁基氢氧化铵，以2 mmol/L四丁基氢氧化铵溶液.甲醇（31:69）为流动相试验，峰型有改善，可保留时间很短（约3。5 min）。将甲醇改为乙腈试验，效果良好。试验了不同配比，最终以2 mmol/L四丁基氢氧化铵溶液.乙腈（64:36）为流动相，效果好。

4.2 反离子试剂的用量与流动相的pH 流动相中反离子试剂四丁基氢氧化铵的用量应控制在1.6-2.2 mol/L。用量低于1.6 mol/L，由于亲和力太低，起不到反离子效果;用量超过2.2 mol/L时，pH值过大，达9。O以上，易损坏色谱柱。经试验，四丁基氢氧化铵的用量在2.0 mmol/L时，pH值为7.2，效果好。

反相离子对色谱法测定马来酸噻吗洛尔

1 仪器、药品与试剂

岛津LC-10AD泵，SPD-10A紫外检测器，CTO-10A柱温箱，C-R6A数据处理机。

马来酸噻吗洛尔（天津中央制药厂），马来酸噻吗洛尔滴眼液（天津市售产品），辅料及中间产物（天津中央制药厂）。

乙腈（色谱纯），磷酸二氢钠（化学纯），辛烷磺酸钠（山东禹王实业总公司化学试剂厂）。

2 色谱条件

色谱柱:YWG-C18（10 μm,4.6 mm×250 mm）;流动相:0.065%辛烷磺酸钠磷酸盐缓冲液[取磷酸二氢钠1.56 g，加水1000 mL,用磷酸（1→10）调节pH至3.50±0.05，加入辛烷磺酸钠0.65 g使溶解，摇匀]-乙腈（70∶30）;流速:0.7 mL·min;检测波长:297 nm;积分仪衰减:0;纸速:1.5 mm·min;灵敏度:0.05 AUFS;柱温:40 ℃，理论板数不低于2 000。

3 实验方法

3.1 色谱条件的选择 经过对不同磷酸盐、不同浓度（0.02，0.01，0.005 mol·L）缓冲溶液与甲醇或乙腈以不同配比（65∶35，70∶30，75∶25）筛选，并对加入不同离子对试剂（己烷磺酸钠及辛烷磺酸钠），比较其不同浓度（0.085%，0.065%，0.045%），不同pH条件（pH=3.0,pH=3.5）。最终选择0.01 mol·L磷酸二氢钠缓冲液[用磷酸（1→10）调pH=3.5]配制的0.065%辛烷磺酸钠溶液与乙腈（70∶30）组成的流动相为最佳条件。另以流动相溶解原料作紫外扫描，最大吸收297 nm为检测波长。

3.2 线性实验 精密取马来酸噻吗洛尔适量（约相当于噻吗洛尔12.5 mg）置200 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度。分别精密取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，进样20 μL,以浓度（μg·mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到噻吗洛尔的回归方程:

Y=875.19X-137.05 r=0.999 3

结果表明浓度在3.0~11.2 μg·mL范围内，线性关系良好。

3.3 有关影响因素实验 取生产厂提供的马来酸噻吗洛尔中间体噻二唑、唑烷进行实验，均对主峰无影响。另按滴眼液处方配制空白辅料溶液，在规定的色谱条件下，基本为一直线，对本实验也无干扰。

3.4 精密度实验 精密称取马来酸噻吗洛尔（980102批）适量（约相当于噻吗洛尔12.5 mg），置25 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，重复进样6次，噻吗洛尔RSD=0.35%,马来酸RSD=0.44%，有较好的精密度。

3.5 加速实验 将原料药980102批及滴眼液980502光照27 d后，实验结果见表1。原料药经光照后比较稳定，色谱图无变化，滴眼液色谱图有明显改变，杂质峰增多，含量下降。本实验说明，该方法能够反映出样品的变化，可以控制产品质量。

4 样品测定4.1 原料药 取本品（约相当于噻吗洛尔12.5 mg），精密称定，置25 mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。精密取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照溶液20 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为记录仪满量程的10%~20%，再取供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍（主成分保留时间应在10 min后），除马来酸峰之外，供试品溶液的色谱图如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和不得大于对照溶液的峰面积。结果见表3。

4.2 滴眼液 精密量取本品1 mL（约相当于噻吗洛尔5 mg）置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取1 mL置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度作为对照溶液，照上述方法检查，应符合规定。

5 讨论5.1 实验中流动相比例的调整，以主峰保留时间在10 min之后为宜，马来酸峰与相邻杂质峰基线分离较好。

5.2 方法中规定记录色谱图为主峰保留时间的3倍，是由于原料药中间体噻二唑的保留时间约为26 min，实验中970601批滴眼液中检出该杂峰。

5.3 本实验供试液自然放置24 h后复测，溶液浓度不变，杂质量不增加，比较稳定。