立克次体IgM抗体检测试剂盒-深圳市科润达生物工程有限公司

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立克次体IgM抗体检测试剂盒（间接免疫荧光法）

仅供体外诊断用

预期用途

R21M-120这个货号的试剂盒用于同时半定量检测人血清或血浆中针对斑点热和斑疹伤寒立克次体的IgM类抗体,作为诊断该病原体感染的辅助工具。

前言说明

斑点热群立克次体在世界各地发现，由蜱和螨（小株立克次体）介导，其通过叮咬传播感染立克次体在西半球发现，以及康氏立克次体（南欧斑疹热）在地中海地区、非洲、印度和亚洲大部分地区发现。许多其他种类的斑点热立克次体也在广泛的地区被发现。

斑疹伤寒群立克次体是由受感染的跳蚤和虱子传播的。这一组包括斑疹伤寒立克次体（地方性斑疹伤寒）和普氏立克次氏体（流行性斑疹伤寒），这两种物种在世界各地被发现。随后的感染引起特异性的抗体反应，可以被检测并用作识别被感染的人的间接手段。

检测原理

立克次体IgM抗体检测试剂盒R21M-120中的IFA载玻片利用纯化的康氏立克次体和斑疹伤寒立克次体作为每个载玻片孔内的单独底物抗原。血清样本至少1:64稀释后加入载玻片孔中与立克次体血清抗体发生反应，然后洗涤除去未反应的血清蛋白，并加入荧光共轭物以标记抗原-抗体复合物。进一步孵育后再次洗涤除去未反应的共轭物，使用标准的荧光显微镜可观察反应结果，其中阳性反应被视为小的清晰的荧光棒状形式分散在红色染色的背景基质中。阴性反应被视为非染色（红色）背景或不同于阳性对照孔中看到的荧光。然后，可以在更高的稀释度下重新测试阳性反应，以确定最高的反应性稀释度或终点稀释度。

所需材料（试剂盒未提供）

1）纯化水（蒸馏水或去离子水）

2）干净的250或500mL洗瓶

3）洗浴池

4）试管

5）精密移液器：100μL

6）24x50mmm盖玻片

7）荧光显微镜（具有FITC（最大激发波长490 nm，平均发射波长530 nm）和400倍放大倍数）

8）37℃水浴锅或培养箱

9）湿盒

立克次体IgM抗体检测试剂盒

储存与处理

试剂盒储存于2-8℃，使用前于先将试剂盒平衡至室温（20-25℃）后,再打开瓶盖或封片

样本收集

先将全血放置凝结后再离心分离血清，转移到一个无菌的密封容器，储存于2-8℃，如果血清样本保存时间超过5天,需置于-20℃或更低保存，急性期样本，立即采集；恢复期样本，需每隔2周或4周，采血一次，观察滴度变化。

样品和试剂的准备

洗涤缓冲液的准备

加PBS包装组分于1L的纯化水中,混匀.

筛查稀释液

首先，用稀释液1:16稀释血清样本，混合均匀后至少反应5分钟，然后高速离心以除去聚集的IgG；取10μL上清液，加入30μL洗涤缓冲液，混合均匀，得到最终稀释度为1:64的筛查稀释液

实验步骤

1）用洗涤缓冲液连续2倍稀释阳性质控品，包括一份高于和一份低于终点滴度（1:512）的稀释度，所有提供的质控品均已1:64预稀释

2）将10μL稀释后的血清加入相应的孔中并标记，将上述制备的所有阳性质控品以及1滴阴性质控品加入相应的孔中，样本应加至孔的顶部或底部，避免加至含抗原微点的中部

3）将载玻片放入湿盒中，并在37℃下孵育30分钟

4）弃去孔中内容物，用洗瓶轻轻冲洗孔，一次冲洗1排，以避免样本混合，然后将载玻片浸泡在含有PBS的容器中至少5分钟

5）在蒸馏水中短暂浸泡后晾干

6）每孔加入1滴共轭物，将载玻片放入湿盒中，在37℃下孵育30分钟，孵育期间应避光

7）重复洗涤步骤

8）每孔加入1-3滴封固剂，并盖上盖玻片

9）在荧光显微镜下放大400倍观察结果，并与阴性和阳性对照孔进行比较，载玻片可在2-8℃下避光保存24小时

质控说明

每次检测都要设阴性对照和稀释阳性对照。阴性对照显示阴性样本的显色情况，没有明显的立克次体体染色特征。阳性对照应该在1:256至1:1024之间有最大终点稀释（即4-16倍的瓶内阳性对照的稀释度）。1:512稀释度的荧光强度可以作为临界(Cut-off)进行判读。如果对照品的显色情况与上述描述不符，检测结果应视为无效。应该重新检查试剂组分和操作步骤，重新检测。

结果判定

阳性反应孔内会清晰地显现明亮的（至少1+）染色多形短棒状形态，通过与阳性质控和阴性质控比较大小,外观和荧光强度等,各种形态都和阳性质控明显不同的则判定为非特异性反应.

初次感染时，(IFA)免疫荧光检测IgG和IgM检测结果都迅速上升。IgM在发病的第三周达到高峰，并持续2-3个月阳性。IgG在发病7-12周时达到高峰，之后缓慢下降，但下降速度比IgM水平慢得多，最终持续大约12个月阳性。