FDA的William Hallett博士曾在2016年的CHI年度会议上专题报告讲述了蛋白聚集体对免疫原性的影响1。报告中提到：在生产过程、产品运输、储存和交付过程中，均可能导致蛋白聚体的形成。由于聚集体可能引起免疫原性，因此聚集体的含量控制是关键质量属性之一。
随着抗体药的发展突飞猛进，抗体的靶点由单一靶向转向多位靶向，抗体开发趋势也呈现多样化，更多转向利用双特异性抗体、抗体药物偶联物(ADC)等技术做创新药的开发；多元化的新药开发也为下游纯化工艺带来更多的挑战。针对聚集体等产品相关杂质的去除成为必须克服的工艺难点。本文将针对使用不同层析原理去除聚集体的策略进行分享：
蛋白A亲和层析MaXtar ARPA：
添加剂助力聚集体去除
蛋白A亲和层析被广泛用于抗体纯化的捕获步骤。由于蛋白A通过Fc区特异性结合抗体，这一步可以显著减少过程相关杂质，包括宿主细胞蛋白和核酸。然而，在典型条件下，蛋白A色谱法去除聚集体的效果较差，已知聚集体比单体结合更强，单独调节洗脱pH通常不足以实现良好的分离。因此，在许多情况下，聚集体的去除往往依靠后续离子交换层析或多模式层析，案例分别介绍：洗涤和洗脱缓冲液中加入氯化钙/聚乙二醇(PEG)或氯化钠/聚乙二醇(PEG)组合，可以显著提高蛋白质A的聚集体去除能力，盐和PEG的协同作用促进单体与聚集体有效分离。
样品信息：澄清后培养液
平衡Buffer: 50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4
洗涤Buffer: 50 mM NaAc-HAc, 500 mM CaCl2, 5% PEG, pH 5.5;
Or 50 mM NaAc-HAc, 750 mM NaCl, 5% PEG, pH 5.5
洗脱Buffer: 50 mM HAc, 500 mM CaCl2, 5% PEG, pH 3.1; Or 50 mM HAc, 750 mM NaCl, 5% PEG, pH 3.1
图1： 添加500mM CaCl2和5%PEG的蛋白A纯化图谱
图2： 未优化和优化方案下蛋白A层析叠加图
小结
图1和图22可见，洗涤和洗脱缓冲液中加入500mM CaCl2和5%PEG，或者750 mM氯化钠和5% PEG显著提高单体-聚集体的分离，SEC纯度有明显提高。
多模式阴离子MaXtar MMA:
通过流穿模式去除聚集体
MaXtar MMA 是一款强阴离子的多模式填料，配基通过多种作用与目标分子结合，如离子作用、疏水作用和氢键作用。MMA经常用于抗体纯化中的精纯阶段，可以去除聚集体、蛋白A配基、HCP、DNA 和病毒等多种杂质。
样品信息：双抗ProteinA洗脱液，聚集体含量11%
平衡Buffer: 50 mM Tris-HAc, pH 7.5
上样：Protein A洗脱液(pH调节到7.5)(载量80 mg/ml)
淋洗Buffer: 50mM Tris-HCl, pH7.5
图3： MaXtar MMA层析图谱
小结
SEC结果表明，双抗的聚集体含量由 11% 下降到至 1.6%。
多模式阳离子MaXtar MMC HR:
通过结合模式去除聚集体
MaXtar MMC HR是一款多模式弱阳离子填料，用于抗体的精细纯化，可以达到去除聚集体、降解片段等多种杂质。
图43：多模式层析图谱
图53：SEC检测图谱
小结
SEC 结果显示，双抗的聚集体含量由 9.6% 下降到了 1.2%。电泳图显示，除聚集体外，轻链缺失的降解片段同样具有很好的去除效果。
疏水层析:去除聚集体
聚集体的疏水性比单体要强，选择高分辨率的MaXtar Phenyl HR，可以高效去除聚集体。
图64：未优化和优化方案下的高分辨率的Phenyl洗脱图谱
小结
图6可见Phenyl洗脱纯度都可以达到98%以上，同时可以通过添加己二醇/精氨酸的方式提高收率。对于自身疏水性比较强的双抗分子，建议可以选择疏水性较弱的填料(MaXtar Octyl/Butyl)，使目的双抗流穿，聚体结合。
参考文献
1、Impact of Aggregates on Immunogenicity of Protein Therapeutics: A Regulatory Perspective
2、Yuan Zhang, Ying Wang, Yifeng Li,A method for improving protein A chromatography's aggregate removal capability. Protein Expression and Purification 158(2019)65-73
3、Yan Wan,Ting Zhang, Yumeng Wang, Ying Wang, Yifeng Li,Removing light chain-missing byproducts and aggregates by Capto MMC ImpRes mixed-mode chromatography during the purification of two WuXiBody-based bispecific antibodies . Protein Expression and Purification 175 (2020) 105712
4、Troii H., et al., Use of mobile phase additives for the elution of bispecific and monoclonal antibodies from phenyl based hydrophobic interaction chromatography resins. Journal of Chromatography B 1096(2018):20-30
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