随着精准化医疗的理念逐渐深入人心，越来越多的治疗用生物制品如双特异性抗体、抗体偶联化药(ADC)以及细胞治疗(CAR-T)获批上市。同时越来越多制药企业布局生物药管线，使得治疗用生物制品研发竞争越来越激烈。因此在早期研发阶段采取合适的工艺开发策略有利于缩短研发时间、节约研发成本，具有很高的竞争力。
 

　　本文综述了生物制品下游纯化常用层析方法(亲和、离子交换、疏水、凝胶过滤、多模式)填料筛选策略，可助力下游纯化的快速工艺开发。
 

　　在设计生物制品下游纯化流程前首先需要明确纯化工艺过程的目的，如收率与纯度的平衡、杂质残留率等。此外还应该对目标产物性质进行充分评估，例如：该目标产物的分子量、等电点、结构特征、亲和力特征等。最后，还应该充分考察目标产物的稳定性如酸碱稳定性、温度稳定性以及可溶解性等，从而初步确定纯化过程中温度以及缓冲体系的选择。目的产物充分了解之后可以选择合适的层析模式进行填料筛选以及优化。
 

　　01　亲和层析
 

　　亲和层析是一种选择性的纯化方法，以两个分子间高度特异性的生物相互作用为基础，从复杂体系中捕获目标分子。因此选用亲和层析来进行纯化时，需要先对目标产物的结构以及亲和力位点进行充分评估。例如，一些重组蛋白会在载体构建阶段引入组氨酸标签，可以选用含镍离子的亲和填料进行捕获；含有GST标签的重组蛋白，则可选用谷胱甘肽亲和层析法。而对于治疗性抗体(单抗、双抗以及多抗)的捕获，通常需要依据抗体结构来进行选择。例如，对于含有完整抗体结构的抗体(含有Fc区域)，通常可以选用protein A以及protein G亲和层析来进行捕获。
 

　　在选定亲和层析填料类型之后，可以选择3-4款该类型亲和填料(可依据填料基架适用性、价格可及性以及供货周期挑选)进行筛选，对于亲和层析来说，由于目标分子与填料配基通过特异性相互作用结合，因此亲和层析装柱子时对称因子只需要保持在0.8-1.8即可。此外还可选用平台化的亲和层析方法来对填料进行筛选，例如，镍离子亲和层析通常选用250 mM的咪唑来洗脱目标产物；而选用protein A 亲和填料纯化抗体蛋白时，则通常选用pH 3.0-4.0的条件洗脱目标抗体。采用平台化的层析方法后，可对目标产物的收率以及纯度进行检测，通常来说初筛亲和层析填料的收率可达到85%以上，SEC纯度可达到80%以上。
 

　　依据最初设定的目标可进一步进行填料优化。在选定填料后，可结合相应的DOE实验设计，对上样(上样样品的pH、cond、以及上样载量)、淋洗(去除杂质)、洗脱等工艺参数进行进一步优化。
 

 

亲和层析原理图

 

　　02　离子交换层析
 

　　离子交换层析是一种依据目标产物与杂质电荷差异而分离的纯化方式，通常用在目标产物的精纯阶段。根据交换离子的不同可分为阴离子交换层析和阳离子交换层析。根据层析目的的不同，离子交换层析过程可选用两种模式：(1)流穿模式：目标产物与填料不结合，而尽量将杂质结合在层析填料上；(2)结合洗脱模式：目标产物与填料结合，再使用一定浓度的盐进行洗脱。选用合适的层析填料以及层析模式，首先就要明确层析目的以及目标产物的等电点PI(电荷性质)，目标产物的PI可以通过目标产物序列计算获得(理论等电点)，也可以通过毛细管等电聚焦电泳(CIEF)来获得(实际等电点)。
 

　　对于等电点低于目标产物等电点的杂质，可选用阴离子层析-流穿模式进行纯化。采用这种层析模式，需要将缓冲体系的pH调节在目标产物以及杂质的等电点之间(高于杂质等电点，低于目标产物等电点)。因此目标产物会带上正电，在层析过程中可以通过收集流穿液来进行纯化，而杂质在该条件下则会带上负电并与阴离子填料结合，需通过再生模式进行去除。此外，采用流穿模式还可以有效去除目标产物中带负电的病毒颗粒。对于流穿模式的填料筛选，通常可运用实验设计(DOE)结合96孔板的方式进行高通量筛选。考察因素可从填料基架(通常分为硬胶和软胶，其中硬胶更加耐压；而软胶则亲水性好，特异性吸附小)、填料粒径(粒径越小分辨率越高，但是反压较大；反之粒径越大分辨率越低，但是更加耐压)以及填料载量(通常采用流穿模式的层析载量会较大，一般高于50 g/L)等角度入手进行试验筛选，并结合收率及质量属性进行效果评估。
 

　　对于等电点高于目标产物等电点的杂质，通常可采用阳离子-结合洗脱的层析模式进行纯化。这种层析模式通常采用盐浓度梯度洗脱的方式对目标产物进行填料筛选、杂质淋洗以及洗脱盐浓度的初步探索。其次依据梯度洗脱的实验结果，结合实验设计(DOE)的策略将梯度实验的结果优化为步级洗脱，并验证其质量属性。对于结合洗脱模式的填料筛选，柱层析筛选的方式，因为结合洗脱模式填料的筛选如果通过96孔板板筛，通常需要12-24小时才能充分结合，难以实现高通量筛选。此外，对于采用结合洗脱模式填料的筛选更应该关注填料的粒径、淋洗以及洗脱时所需的盐浓度(通常生物制品在高盐环境下不稳定，也不利于后续的分析检测)等因素，并且考察相对应的收率和质量属性。
 

 

离子交换原理图

 

　　03　疏水层析
 

　　疏水层析是根据目标产物与杂质之间疏水性差异进行纯化的层析模式。通常来说疏水层析主要应用于高分子量聚体的去除。由于很难直接获得目标产物的疏水性特征，因此在设计疏水层析工艺时首先要用含不同疏水性配基的填料进行预实验，通常来说疏水性配基丁基-辛基-苯基的疏水性依次递增，通过和不同的疏水性填料进行结合吸附试验，可对目标产物的疏水性有一个预判。对目标产物疏水性有大致了解后，应进行目标产物的预处理，通常来说目标产物会在高盐体系下与疏水性填料进行结合，在低盐条件下进行洗脱。因此需要优化层析过程上样时的盐浓度(通常选用硫酸铵作为上样预处理的盐)。此外，初步确定配基种类和上样所需的盐浓度后，可以采用从高盐到低盐梯度洗脱的方式进行填料筛选和工艺优化。后续可以通过实验设计进一步优化为步级洗脱。
 

 

疏水色谱原理图

 

　　04　凝胶过滤层析
 

　　凝胶过滤层析(又称分子筛)，是一种依据分子量大小而进行分离纯化的层析模式。在进行分子筛层析工艺开发和填料筛选阶段，首先要对目标产物以及杂质的分子量有个大致了解。目标产物以及杂质的分子量可以通过凝胶电泳(SDS-PAGE)以及毛细管电泳(CE-SDS)来获得。对于分子筛填料的筛选来说,主要应当关注填料的孔隙直径范围，通常来说孔隙直径越大分离的范围也就越大，例如75 pg的孔隙较小，填料分离范围在3~70KDa，而200 pg的孔隙较大，填料分离范围在10~600KDa，因此首先需要根据纯化需求选择合适的填料。此外还应该关注填料对目标产物的特异性吸附作用，应尽可能减少目标产物与填料的特异性吸附。
 

 

凝胶过滤层析示意图

 

　　05　多模式层析
 

　　近年来有多家填料供应商开发出多模式填料，目前主流的多模式填料有阳离子+疏水以及阴离子+疏水。多模式层析结合了离子交换高分辨率的同时，结合了疏水层析高耐盐的特性，使得层析过程可以在高盐的条件进行上样，从而有更高的可操作空间，适合复杂样品的纯化。多模式层析填料的筛选应当注意目标产物的疏水性，对于疏水性较高的目标产物容易出现难以洗脱的情况(疏水性较高时，离子力以及疏水力的双重作用使得目标产物与填料结合较为牢固难以洗脱，而采用高盐洗脱时会导致填料的疏水性占主导从而导致收率较低的情况)，因此对于疏水性较强的目标产物应当选用配基密度较低的填料，或者在层析过程中添加精氨酸来削弱疏水力进行工艺开发。对于疏水性适中的目标产物则可以通过一系列梯度实验进行填料筛选和工艺开发(例如，单一盐梯度，单一pH梯度，在一定盐浓度下拉pH梯度，在一定pH下拉盐梯度，以及盐和pH双梯度)。
 

 

　　本文综述了亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析以及多模式层析在生物制品下游纯化的应用范围，并且简述了不同层析模式填料的筛选策略，期望为各大生物制品下游研发团队提供工艺开发思路，助力生物制品的下游工艺开发。
 

 

  

 

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　　参考文献