双特异性抗体指的是能同时结合两种抗原(靶点)的抗体，与传统的单特异性抗体相比，双特异性抗体具有特异性强，毒副作用小的优点，因此成为生物药制药领域研发的热点。截至2023年05月全球范围内一共获批上市了10款双特异性抗体(纳米抗体)涉及血液肿瘤、实体瘤、血液疾病、眼科疾病以及自身免疫疾病，此外目前还有超过180种双特异性抗体处于临床实验阶段，其中FDA批准了7款，国内获批了3款(开坦尼、Hemlibra和Blincyto)。因此，在如此“内卷”的赛道上想要实现突破，离不开工艺开发部门的努力。随着上游细胞培养的技术革新，细胞收获液的蛋白效价(Titer)越来越高，因此也就对下游纯化团队带来了更大的挑战，本文浅谈了双特异性抗体纯化的策略以及生产放大。
本期内容框架
• 设计一款双特异性抗体纯化策略所需的先验知识
• 双特异性抗体纯化过程中可能包含的杂质概述
• 双特异性抗体纯化工艺流程简述及开发要点
• 双特异性抗体纯化工艺放大策略
1 设计一款双特异性抗体纯化策略所需的先验知识
首先在开始设计一款双特异性抗体纯化工艺之前，需要对双特异抗体的结构信息有所了解，如下图所示，双特异抗体按照有误Fc片段来看可以分为IgG-like型双特异性抗体以及non-IgG like型双特异性抗体(在捕获阶段，由于non-IgG like型双特异性抗体不含有Fc区域，因此传统的protein A亲和层析就不太适合作为捕获方式，可选则基于轻链的亲和层析，或者混合模式层析来作为捕获阶段的方式)。其次，双抗的亚类选择如IgG1,IgG4，也会影响纯化工艺的制定。此外，目标双抗的等电点的确定对纯化策略的制定具有至关重要的意义(离子交换层析模式的选择，结合洗脱或是流穿模式，需要基于目标抗体以及相关杂质的等电点进行制定)，最后还需要对目标抗体的分子量以及摩尔消光系数进行确定，从而便于期确定以及浓度的检测。
IgG-like与no-IgG like 示意
2 双特异性抗体纯化过程中可能包含的杂质概述
双特异性抗体纯化过程中主要关注两类杂质的去除效果：一类是产品相关的杂质(product-related impurities)具体包括：聚集体(由于变性抗体分子链的延伸缠绕而形成的分子量比较大的杂质)、错配体(由于某些非对称双抗两条链表达具有差异性，从而产生的杂质通常有重链-重链的错配；重链-轻链的错配)、电荷异构体(由氨基酸侧链化学修饰导致，通常来说包括酸性峰和碱性峰)、抗体片段(有某些因素造成的抗体降解，包括半抗，3/4抗体，链缺失等)、糖基化异构体(Fc区域糖基化修饰差异造成的，通常难以通过下游纯化手段去除)。双特异性抗体纯化过程中需要关注的第二类杂质是工艺相关杂质(process-related impurities)具体包括：宿主蛋白(宿主细胞表达或者裂解时所分泌的蛋白类杂质)、宿主DNA(宿主细胞所携带的遗传物质)、内毒素(革兰氏阴性菌所存在的毒性物质)、病毒(可能由宿主细胞本身携带或者工艺过程中引入)、微生物负荷(工艺过程中引入)其他工艺相关杂质(protein A残留，缓冲盐等)。一个合格的下游纯化工艺需要在对产品相关杂质以及工艺相关杂质具有稳定可控的去除能力之外，还要保证有一定的收率。
3 双特异性抗体纯化过程纯化工艺流程简述
及工艺开发要点
如下图所示传统的双特异性抗体的纯化工艺包括：细胞液收获澄清；捕获层析(通常是亲和捕获层析，随着技术的发展混合模式层析以及部分阳离子层析也可以应用于双特异抗体的捕获阶段)；低pH病毒灭活；中度纯化：阴离子层析(通常采用流穿模式)以及阳阳离子层析(通常采用结合洗脱模式)；病毒清除过滤；超滤渗滤。同时随着技术的进步，尤其是混合模式填料的出现使得将传统三步层析模式变为两步层析模式：亲和+混合；混合+离子交换，极大提高了下游纯化的效率。此外，单通道切向流的出现，有效缓解了高浓度双特异性抗体浓缩的挑战，极大降低了成本，提高了工艺稳健性。
典型双特异性抗体下游纯化工艺
细胞液澄清：细胞澄清工艺主要是为了去除生产细胞以及部分可溶性杂质，目前主要用于双特异性抗体澄清的工艺有两种方式：离心以及深层过滤。离心主要原理是由离心力引起固相和液相之间产生密度差异，从而达到澄清的目的。深层过滤主要是利用深层滤器中大孔径介质来截留流动相中的颗粒物质(通常在双特异性抗体澄清工艺中，需要用到一二两级滤器，最终澄清之后的浊度在20NTU左右)。
开发要点：澄清工艺的开发前应当关注细胞收获液的固形物含量、细胞密度、细胞活率、颗粒大小以及HCP、HCD的含量。对于离心澄清来说主要优化的工艺参数有离心力、保留时间以及排渣频率等。对于深层过滤来说，一级滤器主要是用来过滤细胞等大颗粒物质，而二级滤器主要用于过滤小颗粒物质，通常早期工艺开始时，推荐使用3:1的比例来开发一二级滤器。深层滤器的开发只要使用Pmax(恒流法)，即在恒定的流速下进行过滤实验，当压力或者浊度达到终点时结束实验(通常设定压力终点为1 bar, 浊度终点 20 NTU)，计算过滤载量，从而计算所需要的膜面积。
层析工艺：双特异性抗体层析工艺主要分成两块：捕获和精纯/中度纯化，从捕获层析的角度看，目前对于含有Fc片段的IgG-like 型双特异性抗体主要使用基于重链的亲和层析如protein A和protein G亲和层析，而no-IgG-like 型双特异性抗体则可以优先选用基于轻链的亲和层析，目前较多商业化基于轻链(Kappa or lambda)的填料可供选用。此外，由于亲和填料的价格较为昂贵，为此有许多的研究探索对亲和填料进行替代，目前用于抗体捕获的层析方法有混合模式层析以及阳离子层析。
中度纯化和精纯的主要目的是去除大部分杂质(产品相关和工艺相关)，目前双特异性抗体常用的精纯方式有以下几种：离子交换层析(阴离子；阳离子)、混合模式层析(阴离子+疏水层析；阳离子+疏水层析)以及疏水层析。通常来说，阴离子层析选用流穿模式对等电点较低的杂质进行去除，并且由于大部分病毒外壳带负电。因此，也可以通过该方式进行有效去除。阳离子层析通常选用结合洗脱模式，在该模式下可以通过添加淋洗(洗脱力略低于洗脱缓冲液)对等电低的杂质进行去除，此外，还可用通过截峰的方式去除等电点略高于目标产物的杂质。混合模式层析由于同时具有了两种以上的作用力，因此具有更高的分辨率以及更加宽泛的操作空间。对于疏水层析来说，主要适用于去除疏水性差异较大杂质如聚集体。
开发要点：对于捕获层析来说，收率以及纯度是捕获层析应该考虑的要点。通常来说可以考虑通过载量(静态结合载量实验以及动态结合载量实验)，对候选亲和填料进行初筛，然后可以进步优化选定填料的洗脱以及淋洗条件。对于精纯来说，前期可以通过梯度性实验(pH梯度，盐梯度，双梯度)对洗脱以及淋洗条件进行范围探索，在得到相应范围之后，通过DOE实验设计的方法对相应参数进一步优化。
病毒灭活与清除：根据ICHQ5A的要求，下游纯化过程中应当包含两步互补的工艺步骤，通常来说双特异性抗体会采用低pH病毒灭活以及除病毒纳滤的步骤。低pH灭活主要是通过，低pH条件下含有脂包膜的病毒会逐渐变性失活，而对于非脂包膜的病毒，则更多需要通过除病毒纳滤的步骤进行去除，除病毒纳滤的主要原理是，纳滤膜的孔径在20nm左右，可以对一些病毒颗粒进行截留。
开发要点：对于病毒低pH孵育来说，应当关注低pH条件下，以及低pH下孵育时间的对目标双抗活性以及纯度的影响(通常在早期可开发性评估时，应该对抗体pH稳定性就进行评估)，对于除病毒纳滤来说，同常会采用Vmax(恒压法)进行开发，通常以流速衰减为初始流速的40%为过滤终点，从而计算载量和所需的膜面积。
换液浓缩：在双特异性抗体工艺开发过程中，换液浓缩的主要目的是，将目标抗体进行浓缩，并且置换到相应的制剂缓冲液中。对于高浓度制剂来说，由于高浓度会导致样品粘度的升高从而导致工艺时间的延长，因此高浓度制剂的浓缩可以用单通道切向流的膜包。对于换液来说通常需要6-10倍的置换体积。
4 双特异性抗体纯化工艺放大策略
双特异性抗体的纯化工艺放大主要是为了临床用药需求，从而进行的大体积纯化生产，工艺放大的总体要求是产物的质量和收率与小试开发的样品具有可比性，并且整体工艺是稳健的。
层析工艺的放大策略：通常固定层析柱柱高，载量和线性流速和小试工艺开发一致，通过改变层析柱的直径，来进行放大。考虑到工艺的稳定性，在早期工艺开发阶段就应该采用DOE的实验设计思路，来寻求合理的设计空间(保留时间的上下限，载量的上下限)，并且放大过程应该逐级确认例如在小试~3ml层析柱上进行的工艺开发，可现在~50或者500ml层析柱上进行工艺确认，在进行中试放大~5L甚至更大体积层析柱的确认。过滤工艺放大策略：对于过滤来说，通常采用恒定过滤通量的思路，基于小试研发的计算所得膜面积，乘以1.2-1.5的安全系数，即可得到放大生产所需的膜面积。
样品的保存：一般来说样品储存容器的80%为装液上限，同时还应考虑样品冻融的体积变化带来的影响。
5 总结
本文简要总结了双特异性抗体纯化过程中可能遇到的杂质类型以及特点，并且简要介绍了传统双抗的纯化工艺以及开发要点。并且概述了双特异性抗体下游纯化放大的基本策略，本文可为双特异性抗体下游纯化工艺开发及放大提供思路。
参考文献
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