1、制备底层培养基：取直径为90mm平皿，注入约15mL-20mL加热融化的培养基（其中塑料平皿加入15mL，玻璃平皿加入20mL），使其在平皿底部均匀摊布，放置在水平台面上使其凝固，作为底层；

2、制备菌层 ：另取适量培养基加热融化后，放冷至48-50℃（芽孢可至60℃），加入适量的菌悬液（能得到清晰的抑菌圈为度），摇匀，用移液器（枪头灭菌）吸取5 mL上述培养基快速注入平皿*，按同一方向轻轻摇动平皿使其在底层上均匀摊布，作为菌层（注意事项：菌层培养基表面一定要平整，否则会导致漏液）放置在水平台上冷却；

3、放置HB四连式牛津杯 ：用无菌镊子夹住HB四连式牛津杯正面的凸点（*有凸点且平衡翼上标有“海博生物”字体的为产品正面），将其放置在菌层培养基表面上，将压杯板盖上，压住牛津杯5秒左右，使4个小杯与培养基表面紧密接触，防止出现缝隙导致漏液，然后小心拿走压杯板（压杯板已经辐照灭菌，可以直接使用；多次使用，可用酒精棉擦拭即可）；

4、加入抗生素，进行培养 ：向小杯中加入抗生素，将平皿平稳转移至培养箱培养（转移过程中轻拿轻放，避免剧烈震动）……