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Diamond Protein L亲和层析填料纯化抗体片段案例分享
2025-3-14 阅读(48)
背景介绍
Protein L
蛋白L（Protein L）是从大型消化链球菌（Peptostreptococcus magnus）中分离得到的一种多结构域细胞壁蛋白，与抗体的kappa轻链的可变区域相互作用，特别是K1、K3和K4轻链，使其能够与大约67%的人免疫球蛋白和99%的小鼠免疫球蛋白结合[1]。
Diamond Protein L亲和层析介质
Diamond Protein L是将Protein L配基同高刚性琼脂糖基架偶联后制成的一种新型亲和层析介质。相较于常规介质，高刚性琼脂糖基架流速更快，反压更低。Protein L配基与抗体kappa轻链的可变区有很强的亲和性，所以Diamond Protein L适用于从大批量细胞培养液中捕获各种不同大小的抗体片段，如 F(ab')2、Fab、单链可变片段（scFv）和半抗。
Fig. 1 抗体IgG和抗体片段示意图
Diamond Protein L的主要特性
• 高刚性琼脂糖基架：高流速，可提高生产效率
• 高特异性的kappa轻链：可高效捕获广泛选择的抗体和抗体片段
• 高结合载量：能减少工艺时间和介质使用量，降低生产成本
Diamond Protein L技术参数
+颗粒大小呈正态分布，平均颗粒大小是填料体积分布累计的中值粒径
++线性流速 100cm/h，柱高 10cm，缓冲液条件：20mM PB、0.15M NaCl，pH7.2
+++2%苯甲醇仅用于国外运输
实际应用案例——半抗亲和层析
• 层析填料： Diamond Protein L
• 样品和上样量：某半抗，30mg/mL填料
• 平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH7.2
• 洗脱缓冲液：50mM Gly-HCl，pH2.9
• CIP缓冲液: 15mM NaOH
Fig. 2 Diamond Protein L亲和层析图谱
Fig. 3 Diamond Protein L亲和层析纯化结果
使用Tips
（1）缓冲液选择
• 结合缓冲液：通常采用中性缓冲液，如：20mM PB，0.15M NaCl，pH7.2
• 洗脱缓冲液：采用低pH缓冲液，如：0.1M柠檬酸钠 pH2.0~3.5
（2）提高洗脱产品纯度
在洗脱步骤可以通过pH线性梯度洗脱，优化出合适的洗脱pH范围。对于具有挑战性的抗体或抗体片段，纯化中通过优化洗脱缓冲液浓度，可以进一步去除洗脱产品中的聚集体等相关杂质[2]。
（3）在位清洗
如果洗脱产品收率异常，建议在CIP之前再生。在用NaOH进行CIP之前，建议先用中性pH溶液平衡层析柱，避免低pH下缓冲液与高pH NaOH溶液直接接触而可能导致的柱内温度升高的问题。
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参考资料
[1] Serene W. Chen, Darryl Tan, et.al (2020) Investigation of the effect of salt additives in Protein L affinity chromatography for the purification of tandem single-chain variable fragment bispecific antibodies, mAbs
[2] Chen Chen, Tetsuya Wakabayashi et.al(2019) Controlled conductivity at low pH in Protein L chromatography enables separation of bispecific and other antibody formats by their binding valency, mAbs
