微生物和细胞培养中的无菌操作基本技术
无菌操作泛指在培养微生物的操作中,所有防止杂菌污染的方法。日常的生活环境中,每时每刻每处都存在着微生物,任何一个不经意的动作都可能将某种微生物引入到培养物中。在具备无菌环境和获得无菌材料后,还要始终保持无菌状态,才能对某种特定的已知微生物进行研究或利用它们的功能,否则外界的各种微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的现象,在微生物学叫做污染杂菌。防止污染是微生物学工作中十分**的技术:*灭菌和防止污染是无菌技术的两个方面。此外,要有效避免操作者自身被微生物感染,还要防止所研究的微生物,特别是致病微生物或经过基因工程改造了的本来自然界不存在的微生物从我们的实验容器中逃逸到外界环境中去(生物安全)。无菌操作非常重要,无论是倒平板、平板划线操作,还是平板稀释涂布法,其操作中的每一步都需要做到“无菌”,只有熟练、规范地进行无菌操作,才可能成功地培养微生物。
应从操作的各个细节保证“无菌”,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。例如,酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围,等等。
在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求,准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内,然后开始消毒。这样可以避免开始实验后,因器材不全往返拿取而增加污染机会。
无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次(拖布要专用),紫外线照射消毒30-50min,超净工作台台面每次实验前要用70酒精擦洗,然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线,消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置,否则会遮挡射线降低消毒效果。实验用品,如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台,同时紫外线消毒。
原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时,可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时,因整个前臂要伸入箱内,应着长袖的清洁工作服,并于开始操作前要用70%酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需*洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。
在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时,**先要点燃酒精灯。以后一切操作,如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等,都需在火焰近处进行。但要注意:烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织,以免造成组织损伤;吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼,因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜,再用时会把有害物带入营养液中;开启、关闭长有细胞的培养瓶时,火焰灭菌时间要短,防止因温度过高烧死细胞;另外胶塞过火焰时也不能时间长,以免烧焦产生有毒气体,危害培养细胞。
开启无菌操作台风机运转10分钟后,才可开始实验操作,动作要准确敏捷,但又不能太快,幅度不能太大,以防空气流动,增加污染机会。无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞,必要物品,如试管架,移液器或吸管头等可以暂时放置,其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边缘非无菌区域操作。不能用手触及已消毒器皿,如已接触,要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便,工作台面上的用品要有合理的布局,原则上应是右手使用的东西放在右侧,左手用品在左侧,酒精灯置于中央。工作自始**终要保持一定顺序性,组织或细胞在未做处理之前,勿过早暴露在空气中。同样,培养液在未用前,不要过早开瓶;用过之后如不再重复使用,应立即封闭瓶口(敞开直立可增加落菌污染机会)。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时,均应分别使用吸管,不能混用,以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作区讲话或咳嗽,以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方,不要在打开的容器正上方操作实验容器打开后,用手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。瓶口**易污染,加液时如吸管、吸头尖碰到瓶口、瓶外,则应将吸管换掉。每次操作只处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染。验结束后,将实验物品带出工作台,如需要继续进行下一个实验,则用70% 酒精擦拭无菌操作台面,再让无菌操作台风机运转10分钟后,才可进行下一个实验操作。
工作人员应注意自身的安全,**穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心,并选择适当等级的无菌操作台(**少两级)。操作过程中,应避免气溶胶的产生,小心有毒性试剂,例如DMSO(二甲基亚砜),并避免尖锐物品伤人等。