流式细胞术常见问题说明

                                      流式细胞术常见问题说明

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1、流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的？

FL2-W是只检测荧光的脉冲宽度， FL2-H是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用，用于去除粘连细胞。

2、流式同型对照怎样选择？

同型对照（Isotype Control）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用an normal serum（与一抗相同的正常血清） （must be the same species as primary antibody）。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。举个例子：比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a， 所以可以用purified（纯化的） mouse IgG2a来做OX-42的同型对照（Isotype Control）。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。

同型对照：是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F：P比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为*，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照，为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一品牌）的产品。

3、流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙？

在文献及其他专业网zhan中都有测定游离钙的方法，具体如下：

（1） 钙荧光探针负载；

（2）随机测定每管细胞悬液样品（以下简称样品）的单个细胞的荧光强度，记为F值。

（3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化钙，（问题所在），吹打均匀，孵育1~10min，测定荧光即Fmax值。

（4）加入EGTA，20%26mu;l（钙螯合剂），孵育1~10min，激发波长488nm测定荧光，即Fmin值。

因为正常血浆中Ca2＋浓度是1mM，细胞外液的Ca2＋对细胞内Ca2＋有影响。加0.1%triton是增加膜通透性，使细胞外Ca2＋进入细胞内，作为大值。加EGTA是为了螯合Ca2＋，作为小值.环境中细胞内钙离子浓度远低于细胞外液（大约1：10000），细胞膜对钙的通透性变化对细胞内钙影响很大。