人细胞株培养与操作方法

人细胞株操作方法：

（1）取成年新西兰大白兔，耳缘静脉注射空气处死后，取下兔子的双腿，立即用75%乙醇浸泡。

（2）移入细胞房内，去除双腿表面的皮毛及肌肉，剪取关节段，移至超菌工作台内。

（3）PBS洗涤数次，用手术刀或弯剪将关节表面的软骨组织取下。

（4）软骨组织块静置5min，弃去上层液体及悬浮组织，将软骨组织剪成1mm3的大小。移到离心管中加3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化15-20min；

（5） 4℃静置5min；弃上清，PBS洗涤，去上清。加入0.2%胶原酶II，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化2H；
（6）加入生长培养基终止消化，反复吹打后依次通过200目滤网。收集滤液,1200rpm离心8min，弃上清，用DMEM*培养基重新悬浮细胞, 放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

（7）细胞传代后放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。细胞*展开后即可固定做原代鉴定。

人细胞株培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。