逆转录PCR反应技术与反应体系

PCR反应需要以双链DNA作为模板，因此最初的PCR反应用于检测目标样本的基因组中是否存在特定的目的片段，但是这种以基因组DNA为模板的PCR反应无法检测目的基因是否在样本中表达，此外由于真核生物的基因中存在内含子，直接通过基因组DNA进行PCR也很难确定样本中是否存在目的基因，针对这一问题，发展出了逆转录PCR的技术。

技术原理

逆转录PCR (reverse transcription PCR，RT-PCR) 是以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA，之后再进行PCR的过程。

mRNA逆转录合成cDNA的过程分为两步：

在特定引物的介导下，通过逆转录酶的催化下以mRNA为模版合成互补的cDNA第一链；

升高温度使cDNA第一链与mRNA解离，然后降温，使其与另一引物退火结合，并由DNA聚合酶催化延伸生成cDNA第二链。

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品的分析成为可能，该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

逆转录反应体系

1. RNA模板

通常20μL的逆转录体系，加入总RNA 1μg，如果总RNA加入过多，会导致逆转录不充分。

2. 引物

常用的有随机引物和Oligo(dT)引物：

随机引物会将所有RNA分子均进行逆转录，此时得到的cDNA大部分来源于rRNA，主要在部分mRNA含有逆转录酶终止序列而难以得到其全序列时使用；

Oligo(dT)与真核生物mRNA的Poly(A)区域匹配，可以特异性的对mRNA进行逆转录。

3. 逆转录酶
逆转录过程涉及以RNA为模板合成DNA和以DNA为模板合成互补链的两个过程，目前市场上的逆转录酶都同时具有这些功能，因此只需在反应体系中加入逆转录酶即可，而不需额外加入DNA聚合酶。

4. 4种dNTPs