哺乳动物细胞冷冻保存
主要目的：
（1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的zui主要目的。
（2）减少细胞被微生物污染的危险性。
（3）减少细胞之间交叉污染的危险性。
（4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。
（5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。
（6）降低人力和物力。
冷冻保存要点：
（1）冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在4℃冰箱中放置30－60分钟；然后转入-20℃，放置30分钟；然后再转入-80℃放置16－18小时（或过夜）；zui后放入液氮中长期保存。有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1到-3℃速度降温，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中长期保存。
（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。
（3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。
（4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下，用于冷冻保存*细胞生长培养液中血清浓度大于20％。
（5）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，zui常用的冷冻保护剂是DMSO（二甲基亚砜），使用终浓度为5－10％。但是，有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。因为，DMSO能诱导HL-60细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）等。
特别注意：
（1）细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。
（2）DMSO稀释时会释放大量热量。因此，DMSO不能直接加到细胞液中，必须事先配制。
（3）DMSO必须是细胞培养级别的。新买的DMSO本身处于无菌状态，*次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4℃保存。避免反复冻融造成DMSO裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO的尼龙滤膜。细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂，基础培养液，血清或蛋白。
常用细胞冷冻保存液：
（1）10％DMSO＋*细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）
（2）10％甘油＋*细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）悬浮细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）：
（1）取对数生长期细胞培养物，离心200－400g5分钟。用粘附（贴壁）细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）：
（1）冷冻保存细胞的解冻与复苏要点：（1）快速解冻。冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1分钟内全部融化（不要超过3分钟）。
（2）解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含*生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1ml冻存细胞液加入到25－30ml新鲜*培养液中），24小时后再用新鲜*培养替换旧培养液，以去除DMSO。如果，细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含*生长培养液的培养瓶中。
特别注意：
（1）解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。，要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免冻伤。
（2）冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染。
解冻冷冻保存细胞的离心方法:
（1）从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴中快速解冻。
（2）将1－2ml冻存细胞液加入到25ml新鲜*细胞生长培养液中，轻轻混匀。
（3）用80g离心2－3分钟，弃上清液。
（4）用*生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞。
（5）接种细胞到培养瓶中，起始密度为3×105/ml。
