细胞实验知识-正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备

【实验目的】

掌握微量全血培养及正常细胞和肿瘤细胞常规核型的标本制备技术。了解正常及肿瘤

细胞核型的一般特征。

【实验用品】

一、材料和标本 健康人的外周血、培养的 HeLa 细胞和 HL—60 细胞。

二、器材和仪器 超净台、煤气灯、乳胶管、火柴、镊子、废液缸、离心机、水浴箱、

定时钟、天平、离心管（10m1）、乳头吸管、显微镜、载玻片、平皿等。无菌器材有培养瓶、

培养皿、注射器（5ml、lml）、注射针头、刻度移液管（5ml、2ml、lml）、吸管等。

三、试剂 1640 培养液、500 单位／ml 的肝素溶液、10μg／ml 的秋水仙素溶液、0.25

％胰蛋白酶一 0.02％EDTA 混合消化液,O．5mg／ml 的 PHA 溶液、0.075mol／L 的 KCl 溶液，

甲醇、冰醋酸、Giemsa 原液、磷酸缓冲液（pH6.8）、生理盐水等。

【实验内容】

一、微量全血培养

（一）原理

人体外周血中淋巴细胞是成熟的免疫细胞，正常情况下处于 G。期不再增殖。

PHA（Phytohemagglutinin，植物血凝素）是人和其它动物淋巴细胞的有丝分裂刺激剂，它能

使处于 G0 期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进入细胞周期开始旺盛的有丝分裂。

人体微量全血培养是一种简单的淋巴细胞培养方法。此法采血量少、操作简便，在 PHA

作用下进行短期培养即可获丰富的、有丝分裂活跃的淋巴母细胞，适于制备核型标本。各

种因素的效应（如病毒、电离辐射、化学药剂等）也可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，

从而进行多种在体内无法进行的研究。因此它是细胞生物学及其它学科研究中的一种有效

的方法。

（二）操作

1．打开超净台紫外灯 20～30 分钟。洗手、换洁净白大衣后进入操作室。启动超净台，

点燃煤气灯。用 75％酒精棉球擦洗手、各种试剂瓶及操作台面，然后将培养液及肝素、秋

水仙素、PHA 等所需溶液移入超净台。

2．在超净台内将每个培养瓶装入 5ml 培养液及 0.2ml PHA 溶液，封好备用。

3．用 5ml 注射器，7 号针头，先吸取少许肝素湿润针筒，然后从肘静脉抽血 l～2ml。

每个培养瓶接种全血 O．2ml 左右轻轻摇动使血和培养液混匀。

4．在培养瓶上标记好供血者姓名、性别、采血日期等，放入培养箱中 37℃培养。每天

轻轻震荡培养瓶二、三次，防止血球沉积并保证血细胞与培养液充分接触，促进细胞生长

繁殖。

二、人淋巴细胞染色体标本制备

（一）原理

在淋巴母细胞分裂高峰时加入秋水仙素，破坏细胞纺锤体的形成，使细胞停止在分裂

中期。然后收集细胞，低渗处理，使细胞胀大，染色体伸展。接着进行固定并除去中期分

裂相中残存的蛋白质，使染色体清晰且分散良好。再结合离心技术去掉红细胞碎片，然后

采用空气干燥法制片获得中期染色体标本。

（二）操作

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1．微量全血细胞培养至 68 小时左右，用 1ml 注射器针头向每个 5ml 培养瓶内加 2 滴

秋水仙素溶液，摇匀后继续培养 3 小时，此项操作不需要严格无菌。

2．按时终止培养，用吸管温和吹打成细胞悬液后，移至 10ml 离心管中。用天平平衡

后以 1000rpm 离心 8 分钟，弃大部上清，剩 0.5ml。再吹打成细胞悬液，加入预热 37℃的

0.075mol／L 的 KCL 溶液 9ml，置 37℃水浴中低渗处理 30 分钟（这期间配制 3:1 甲醇一冰醋

酸固定液）。

3.向离心管中加入 1ml 固定液预固定。平衡后以 1000rpm 离心 8 分钟，同样剩 0.5ml

上清。

4．轻轻将细胞吹成悬液，加 5~6ml 固定液，室温下固定 30 分钟。然后离心，弃上清，

重复固定一次。再离心，留 0.1～0.2ml 上清，吹打成细胞悬液。

5．吸取 1～2 滴悬液，在距载片约 15cm 高度滴于预冷的干净载玻片上，迅速对准细胞

吹气促进染色体分散。斜放载玻片，在空气中晾干（此期间配制 Giemsa 染液，Giemsa 原液

和磷酸缓冲液 1:10）。

6．将标本面朝下放在染色槽中，加入染液染 10 分钟，自来水冲洗，晾干后观察。

（三）结果

低倍镜下，制片质量较好的标本上可看到有较多的分裂相，染色体之间分散良好，互

不重叠。

油镜下观察可见每一条染色体都含有两条染色单体，两条单体由着丝粒相结。分区计

数染色体数目并判定性别，或拍照后进行核型分析。

三、肿瘤细胞的染色体标本制备

（一）原理

利用肿瘤细胞无限繁殖的特点，掌握其体外生长动态，取处于对数生长期的细胞便可

获得丰富的分裂相。肿瘤细胞染色体异常包括两个方面：

1．结构异常 即在肿瘤细胞常出现的染色体畸变，包括双着丝点染色体、环状染色体、

断裂的染色体、染色体裂隙及微小体等。

2．数目异常 由于肿瘤细胞分裂失去应有的调控，可出现亚二倍体、超二倍体和多一

倍体数目异常现象。

肿瘤细胞染色体制备技术在细胞生物学、医学遗传学的基础研究和临床诊断、愈后观

察等方面均有广泛用途。

（二）操作

l．以 1.6× 10 5 个／ml 细胞浓度将 FL—60 细胞接种于培养瓶内，48 小时后以终浓度

为 0.04μg／ml 的秋水仙素处理 2.5 小时，移入 10ml 离心管。其余步骤与淋巴细胞染色体

制备相同。

2.将长成单层的 HeLa 细胞按 1:2 传代进行培养，36 小时后用终浓度为 0.04μg／ml

的秋水仙素处理 3 小时。按时终止培养，用 0.25％胰蛋白酶一 0.02％EDTA 混合消化液处理

单层细胞，待细胞收缩变圆时，弃去消化液。加入少许低渗液将细胞从瓶壁洗脱，移入 10ml

离心管，加入预热 37℃的低渗液至 5 ~ 6ml，在 37℃处理 25 分钟。以下步骤同淋巴细胞染

色体核型制备。

（三）结果

计数 HeLa 细胞和 HL—60 细胞的染色体数并寻找是否有畸变的染色体。

附：人体染色体常规核型的分析

一、人体染色体的观察

取制备较好的染色体玻片标本，先在低倍镜下观察。在标本中选择一个染色体之间分散

较好，互不重叠的中期分裂相，置于视野*，然后换油镜仔细观察。每个染色体都含有

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两条染色单体，两单体连接处为着丝粒。计数时要把分散的染色体划分为几个区域以免计

数重复或遗漏，然后计数并判定性别。

二、核型分析的方法

人体染色体常规核型的分析，在今天的染色体研究水平上作为染色体结构异常的疾病

诊断已经失去意义，但对染色体数目异常仍具有诊断上的价值，尤其是起着分析其它几种

显带核型的桥梁作用。通过常规核型的分析必须掌握三点：（一）会分组、（二）了解各组染

色体的基本形态特征、（三）会计数数目和鉴定性别。

人体染色体的常规核型即按照 Denver 会议（1960 年）提出的染色体命名和分类标准，将

人类体细胞的 46 条染色体按大小、着丝点的位置分成七组（A、B、C、D、E、F、G、）23 对

的排列。

七组染色体的基本形态特征及分析顺序是：

A 组是七组染色体中zui大的一组，首先找出它。A 组包括三对，即第 1~3 号 6 条染色体，

第 1 号为zui大、是*着丝点，长臂近侧有次缢痕；第 2 号第二大、着丝点略偏离*；

第 3 号为三大，是*着丝点。

接着确定 B 组：B 组二对即第 4～5 号 4 条染色体，较大，均为亚中着丝点，两者不易

区分开。

第三确定 D 组和 G 组：D 组三对即第 13～15 号 6 条染色体，中等大小均为近端着丝点，

短臂末端有随体。G 组二对即第 21～22 号 4 条染色体，是zui小的一组，均为近端着丝点，

短臂末端有随体，长臂常呈分叉状，21 号稍小于 22 号。Y 染色体被隶属于该组，短臂无随

体，一般较 2l、22 号大点。

第四确定 F 组：F 组二对即第 19～20 号 4 条染色体，染色体比 G 组稍大、均为*着

丝点。

染色体分组形态特征表

第五确定 E 组：E 组三对即第 16～18 号 6 条染色体，较小，第 16 号是*着丝点，17、

18 号是亚中着丝点。

余者为 C 组：C 组七对即第 6～12 号 14 条染色体，按大小顺序依次排列，均是亚中着

丝点；X 染色体被隶属该组，大小居 6～7 号之间，是亚中着丝点。

上述人的常规核型中，1～22 号为常染色体，男女共有，另一对为性染色体，决定性别，

男性为 XY，女性为 XX，人的正常核型写法：男 46，XY；女 46，XX。