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乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒说明书
2015-6-11 阅读(3446)
 提 供 商 |
齐一生物科技（上海）有限公司 |  资料大小 |
23.3KB |
|---|---|---|---|
 资料类型 |
PNG 图片 |  资料图片 |
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3446次 |
乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）试剂盒说明书
分光光度法 50 管/24 样
测定意义：
LDH（EC 1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，
催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着 NAD+/NADH 之间互变。
测定原理：
LDH 催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸， 丙酮酸进一步与2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二
硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰
和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：30mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂一：液体15 mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入 1.3 mL 蒸馏水充分溶解备用，配好后-20℃保存，
可保存两周，禁止反复冻融；
试剂三：液体15 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂四：液体50 mL×1 瓶，4℃保存；
样品测定的准备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104
个） ：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL 提
取液） ，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔10s，重复 30 次） ；
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g） ：提取液体积(mL)为 1：5~10的比例（建议称取约 0.1g组织，
加入1mL 提取液） ，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 450nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在 EP 管中加入下列试剂）
试剂名称(μL) 测定管 对照管
样本 50 50
试剂一 250 250
试剂二 50
蒸馏水 50
充分混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴15min
试剂三 250 250
充分混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴15min
试剂四 750 750
充分混匀，室温静置3 分钟，450 nm 下测定吸光度，计算ΔA=A 测定管-A对照管。每个测
定管需要设一个对照管。LDH 活力单位的计算：
1、标准条件下测定的回归曲线， y = 0.725x (x 为标准品浓度，umol/mL；y 为对吸光度)。
2、血清（浆）LDH 活力的计算
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（U/mL）=ΔA÷0.725÷T×103
=92×ΔA
3、细胞、细菌和组织中 LDH 活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（U/mg prot）=[ΔA÷0.725×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103
=92×ΔA÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（U/g 鲜重）=[ΔA÷0.725×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103
=92×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（U/104
cell）= [ΔA÷0.725×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103
=0.184×ΔA÷W
V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL； V2： 加入提取液体积， 1 mL； T： 反应时间， 15 min；
Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
