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利用蛋白质阵列研发 Spindlin1 小分子抑制剂
2017-8-4
生命中心李海涛研究组于《自然化学生物学》(Nature Chemical Biology)正式发表题为《应用蛋白阵列技术研发 Spindlin1 小分子抑制剂》(Developing spindlin1 small-molecule inhibitors by using protein microarrays)的合作研究论文,通过构建组蛋白阅读器结构域蛋白芯片,并结合基于结构的构效关系演化,开发出专门针对 Spindlin1 的活性小分子抑制剂,为今后模式结构域(modular domain)靶向的药物筛选与开发提供了一种新技术模式。
图 1 利用蛋白阵列筛选小分子抑制剂
组蛋白修饰是表观遗传调控基本机制之一,被认为构成一类“组蛋白密码”,调控着遗传信息在染色质层面的组织与解读。组蛋白修饰的一种作用模式是招募一类被称作“阅读器”(reader)的效应因子,通过调节染色质开关状态而调控基因活度和染色质结构,进而影响细胞分裂、增殖、分化和凋亡等众多细胞进程。值得注意的是,在癌症等众多疾病中存在组蛋白修饰及其“阅读器”识别紊乱调控的现象。近年来,组蛋白“阅读器”逐渐成为药物研发中的一类重要靶点,一个的例子是 BRD4 的 Bromo 结构域。能够识别组蛋白修饰的“阅读器”结构域种类繁多,如 PHD 锌指、Tudor、Chromo、PWWP、MBT、BAH、Bromo、YEATS 等,他们能够以修饰位点和类型特异的方式来识别并破译“组蛋白密码”。因此,寻找针对组蛋白阅读器的特异抑制剂,是当前表观遗传领域药物研究的一个热点。
组蛋白甲基化是一类重要的组蛋白修饰,主要发生在赖氨酸和精氨酸等残基上,通常可以被“阅读器”中的芳香笼口袋(aromatic cage)识别并解读。鉴于芳香笼口袋的结构相似性,开发特异靶向不同甲基化“阅读器”的小分子抑制剂成为一个领域挑战。本研究首先通过构建组蛋白赖氨酸甲基化“阅读器”结构域蛋白阵列芯片,其中涉及隶属 Tudor、Chromo、PHD、BAH、MBT、PWWP、ANK、AGENET、HEAT 等类型的蛋白结构域共 98 个;随后,采用一种基于荧光的检测手段对生物素标记的小分子抑制剂进行针对该 98 个潜在“阅读器”靶点的“lab-on-chip”高通量评估和筛选。利用该项技术研究组成功筛选出 EML405 小分子的潜在靶点 Spindlin1、PHF20、L3MBTL1、53BP1 等,并在体外结合实验中得到验证。
李海涛研究组曾于 2014 年在《基因与发育》发文报导 Spindlin1 是一类新型组蛋白“阅读器”,其含有三个串联重复类 Tudor 结构域,通过前两个类 Tudor 结构域特异性识别组蛋白“赖氨酸 - 精氨酸”甲基化组合,H3“K4me3-R8me2a”,进而激活 Wnt 靶基因的转录,是结肠癌等诸多癌症发生中的促癌因子。以 Spindlin1 为突破点,李海涛研究组通过 X 射线晶体衍射技术揭示了 EML405 小分子结合 Spindlin1 的结构基础。研究发现 EML405 小分子的两臂恰巧结合在 Spindlin1 的前两个功能性芳香族口袋中,阻断其对组蛋白 H3“K4me3-R8me2a”的识别。在 Spindlin1-EML405 的复合物结构基础上,研究人员进一步优化出 EML405 小分子的衍生体 EML631、EML632、EML633,并系统的开展了 EML631-633 与 Spindlin1、PHF20、L3MBTL1、L3MBTL3、53BP1 靶点的定性、定量结合分析。结果发现 EML 衍生小分子能够大大提高 Spindlin1 靶点的识别特异性,其中 EML631 以 4 微摩尔亲和力结合 Spindlin1,而对 PHF20、L3MBTL1、L3MBTL3、53BP1 靶点的结合能力降到亚毫摩尔级别。Spindlin1-EML631 的晶体结构解析进一步揭示了 EML631 对 Spindlin1 高度选择性的分子机制。同时,RNA-seq 和 ChIP-qPCR 结果显示,EML631 能够有效抑制 Spindlin1 激活基因转录的活性。因此,本工作以组蛋白“阅读器”蛋白芯片为切入点,开发出针对 Spindlin1 靶点的特异性小分子抑制剂,这为今后以模式结构域为靶点的特异小分子筛选开发建立了一个新型研发模式。
本论文是李海涛教授与美国得克萨斯大学 MD 安德森癌症中心 Mark Bedford 教授、意大利萨莱诺大学 Gianluca Sbardella 教授共同合作成果。其中李海涛教授实验室负责了结构解析与结合实验、Mark Bedford 教授实验室负责了蛋白阵列制备与细胞功能实验、Gianluca Sbardella 教授实验室负责了小分子化学合成与演化工作。生命科学联合中心博士后苏晓楠为论文并列*作者,清华大学 2016 级博士生白雪参与了该项工作。本课题得到科技部国家重点研发计划、教育部自主科研计划、生命科学联合中心、北京结构生物学高精尖创新中心等资助。衍射数据收集得到上海同步辐射光源 BL17U 线站的大力支持与协助。
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