细胞氧化应激活性氧羟自由基比色法定量检测试剂盒齐一生物科技（上海）有限公司产品已被广泛应用于化学、化工、生命科学的基础研究和开发应用、制药、疾病诊断与控制、人口与健康、生物技术等诸多领域.客户遍布国内各大学、研究所、医院、卫生防疫、商品检验检疫、制药公司、生物技术公司和食品工业等单位.齐一生物科技（上海）有限公司：.www.qiyibio。。ｃｏｍ

细胞氧化应激活性氧羟自由基比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
细胞氧化应激活性氧羟自由基比色法定量检测试剂是一种旨在通过捕获剂二甲基亚砜，受到羟自由基的氧化，进而与偶氮染料反应，产生黄色产物，由分光光度仪比色分析未反应棕色成分，来定量检测细胞内羟自由基活性氧族的生成和增加的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种细胞（动物、人体等）裂解悬液或培养上清的羟自由基检测，以及羟自由基激发剂和抗氧化清除剂（scanvenger）等的检测。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。
技术背景
超氧自由基阴离子（superoxideradical；O2-）、过氧化氢（hydrogenperoxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxylradical；OH-）、过氧化基（peroxylradical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxylradical）、氮氧基（nitricOxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitriteanion；ONOO-）次氯酸（hypochlorousacid；HClO）、半醌自由基（semiquinoneradical）、单线态氧气（singletoxygen）等细胞内活性氧族（ReactiveOxygenSpecies；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。其中羟自由基或氢氧基具有极度反应性和毒性，同时半衰期短（10－910－10秒）。其产生主要是水分子受到高能量放射后裂解、过氧化物和次氯酸反应、过氧化氢的还原、超氧化物的歧化等形成。使用二甲基亚砜（dimethysulfoxide；DMSO），作为羟自由基的分子探针，捕获羟自由基，并被氧化为甲基亚磺酸（methanesulfinicacid；MSA），在偶氮染料（diazoniumdye）的作用下，产生黄色产物偶氮亚砜（diazosulfone），通过分光光度仪（325nm波长），检测未反应棕色成分，以测定羟自由基的含量。据此证明细胞内活性氧族的存在。其反应系统为：
产品内容
清理液（ReagentA）                                毫升
标记液（ReagentB）                                微升
酸性液（ReagentC）                                微升
染色液（ReagentD）                                瓶
终止液（ReagentE）                                毫升
萃取液（ReagentF）                                毫升
标准液（ReagentG）                                毫升
产品说明书                                            1份
保存方式
保存染色液（ReagentD）和标准液（ReagentG）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（ReagentC）具有腐蚀性，注意操作安全；终止液（ReagentE）和萃取液（ReagentF）容易挥发，注意密闭；染色液（ReagentD）避免光照；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于标准液配制的容器
2毫升离心管：用于样品操作的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
DOUNCE匀浆器：用于细胞裂解
台式离心机：用于样品制备和反应处理
石英或玻璃比色皿：用于比色分析的容器
分光光度仪：用于比色分析
实验步骤
一、样品准备
选择一：培养细胞
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（15X106细胞）
2．小心抽去培养液
3．小心加入xx毫升清理液（ReagentA），覆盖生长表面
4．小心抽去清理液
5．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
6．加入xx毫升清理液（ReagentA），混匀细胞
7．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
8．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
9．小心抽去上清液
10．加入xx毫升清理液（ReagentA）
11．强力涡旋震荡15秒
12．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
13．在冰槽里用研磨棒匀化细胞（约80下）
14．将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
15．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为10000g
16．小心移取3毫升上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管
17．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
18．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
选择二：细胞培养液
1．移取3毫升细胞培养液到15毫升锥形离心管
2．放进台式离心机离心5分钟，速度为10000g
3．小心移取3毫升上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管
4．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、标准样品配制
1．准备好5个1.5毫升离心管，标记为15号管
2．分别加入xx微升清理液（ReagentA）到25号管
3．移取xx微升标准液（ReagentG）到1号管
4．小心移取xx微升1号管的标准液（ReagentG）到2号管，混匀
5．小心移取xx微升2号管稀释的标准液（ReagentG）到3号管，混匀
6．小心移取xx微升3号管稀释的标准液（ReagentG）到4号管，混匀
7．将15号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

管号    清理液（ReagentA）    标准液（ReagentG）    测定体系标准MSA浓度
1    －    xx微升    xx微摩尔/升
2    xx微升    xx微升1号管    xx微摩尔/升
3    xx微升    xx微升2号管    xx微摩尔/升
4    xx微升    xx微升3号管    xx微摩尔/升
5    xx微升    0    0
三、标准曲线测定
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（ReagentD）置入室温下，然后移出xx毫升清理液（ReagentA）到染色液（ReagentD）瓶里，混匀后，标记为染色工作液，使用锡箔纸包裹避光，置于冰槽里备用（注意：可以使用12次）。放在暗室里备用。然后进行下列操作

1．移取xx微升上述配制的标准液（ReagentG）到2毫升离心管
2．加入xx微升酸性液（ReagentC）
3．加入xx微升染色工作液，手动混匀
4．室温下孵育10分钟，避免光照
5．加入xx微升终止液（ReagentE），手动混匀
6．加入xx毫升萃取液（ReagentF），手动混匀
7．小心移取1毫升上层浅棕色液相到新的比色皿
8．即刻（3分钟内）放进分光光度仪（325nm波长）检测：获得吸光读数
9．重复实验步骤18四次
10．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准MSA浓度（微摩尔/升）
四、样品测定
1．移取200微升待测样品到2毫升离心管
2．加入xx微升标记液（ReagentB）
3．涡旋震荡5秒
4．室温下孵育30分钟
5．加入xx微升酸性液（ReagentC）
6．加入xx微升染色工作液，手动混匀
7．室温下孵育10分钟，避免光照
8．加入xx微升终止液（ReagentE），手动混匀
9．加入xx毫升萃取液（ReagentF），手动混匀
10．小心移取1毫升上层浅棕色液相到新的比色皿
11．即刻（3分钟内）放进分光光度仪（325nm波长）检测：获得吸光读数
12．根据标准曲线获得样品对应MSA浓度，即羟自由基浓度（微摩尔/升）
13．计算样品实际MSA浓度，即羟自由基浓度（微摩尔/升）
14．或构建细胞内活性氧生成曲线：纵座标（Y轴）为羟自由基活性氧吸光值（OD）；横坐标（X轴）为组织量、蛋白量、时间点或药物处理浓度等
注意事项
1．本产品为20次操作
2．操作时，须戴手套
3．酸性液（ReagentC）具有腐蚀性，注意操作安全
4．终止液（ReagentE）和萃取液（ReagentF）容易挥发，注意密闭
5．建议染色工作液现配现用为佳
6．孵育时，必须避免光照
7．建议使用新鲜样品
8．建议使用石英或玻璃比色皿
9．本产品适合抗氧化能力检测
10．用户可以使用320360nm之间的任一波长进行检测
11．如果读数大于1.5，可以使用萃取液（ReagentF）予以稀释，但注意计算公式的稀释倍数变化
12．本公司提供系列氧化应急活性氧检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
所致，本公司不承担由此造成的损失。