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杨艳 连浩志

二维液相色谱技术

二维液相色谱分离技术是利用两根性质不同的色谱柱对复杂样品中的待分析组分进行分离。不同的液相色谱模式如排阻色谱（SEC）、亲和色谱、离子交换色谱（IEC）、疏水作用色谱（HIC）、反相色谱（RP）等都可以用来组合、构建二维液相色谱。

近年来二维液相色谱分离技术被广泛应用于抗体药物领域。中心切割二维液相方法和全二维液相方法的工作流程用于指导抗体药和生物类似药研发过程中的单克隆筛选。一维使用亲和色谱方法，二维使用排阻色谱（SEC）、阳离子交换（CEX）或反相色谱串联质谱法可以评估抗体的滴度、关键结构特征比如聚集体、片段、电荷异质体、分子量、氨基酸序列和糖基化[1]。Yi Li[2]等人利用中心切割二维液相方法分析ADC药物中的未偶联小分子相关杂质，该方法的一维是排阻色谱（SEC），将ADC药物和未偶联小分子相关杂质分离开；然后使用中心切割的方式，将一维的未偶联小分子相关杂质切割到第二维反相色谱串联质谱，进行在线除盐、未偶联小分子相关杂质鉴定并测定含量，3种未偶联小分子相关杂质的线性均为0.9999，回收率在95%-105%。

抗体药Actemra

Actemra（托珠单抗）是重组人源化IgG1抗体，是人源化白细胞介素6（IL-6）受体拮抗剂。Actemra用于治疗类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎等。

图1.托珠单抗Actemra（图片来源于网络，如涉及侵权，请告知，立删）

SEC-RP串联质谱的二维液相色谱

高效表征Actemra

本实验一维使用排阻色谱法（SEC）测定抗体药Actemra的聚集体、主峰、片段含量。因为一维使用流动相是质谱不兼容的盐，所以将一维的各个峰进行中心切割，切到loop环中，然后使用二维质谱兼容的流动相将loop环中的馏分冲到二维反相色谱柱中进行除盐并将目标物洗脱进入质谱检测器进行检测。

01

仪器配置：

· Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex 系列液相色谱

· Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 质谱仪

· Thermo Scientific™ BioPharma Finder™ 软件

02

一维色谱条件：

分析柱：SEC色谱柱

柱温：室温

进样量：2 µl

流速：0.15 mL/min

流动相：100 mM PB+100 mM NaCl，pH7；等度

紫外检测器：280 nm

03

二维色谱条件：

分析柱：MAbPac™ RP（2.1 X 50 mm）

柱温：60℃

紫外检测器：280 nm

流动相：流动相A：0.1%FA-H2O；流动相B：0.1%FA-ACN；

流动相梯度表：见图2

图2.二维流动相梯度表

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04

质谱参数设置：

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实验结果：

抗体药Actemra的SEC-HPLC的谱图见图3，该样品主峰含量97.0%，片段1含量2.0%，片段2含量0.2%。以上含量按峰面积百分比进行计算的。

图3. 抗体药Actemra的SEC-HPLC谱图

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根据目标峰的峰保留时间对2位6通阀进行阀切换。主峰选择7.0-7.5min时间段切到250 μL的loop环中，片段1选择7.5-8min时间段切到250 μL的loop环中，片段2选择8.7-9.2min时间段切到250 μL的loop环中。主峰的去卷积结果见图4，根据已知氨基酸序列进行数据处理，得到相应的分子量和对应糖型修饰。片段1的去卷积结果见图5，该片段的分子量约为100 KD，推测是两条重链组成，具体的还需通过肽图做进一步鉴定。另外片段1去卷积后相邻分子量均相差约162 Da（除100551 Da之外），推测是相差一个糖修饰。片段2的总离子流图、去卷积结果图和原始质谱图见图6-8，尽管片段2含量只有0.2%，利用二维液相的方法，在线中心切割到第2维反相，保留时间为19.382min，总离子流图的响应强度有2.7E8，在当前质谱仪器上有很好的响应，完quan可以进行在线检测。片段2的分子量约为47 KD，具体的还需通过肽图做进一步鉴定。

图4.主峰的去卷积谱图

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图5.片段1的去卷积谱图

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图6.片段2的总离子流图

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图7.片段2的原始质谱图

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图8.片段2的去卷积谱图

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结论：

通过一维排阻色谱法（SEC）分离抗体药Actemra的聚集体、主峰、片段；通过二维反相色谱柱进行除盐并将目标物洗脱进入质谱检测器进行检测鉴定，该方法可以快速获得抗体药物的聚集体、主峰、片段的含量，同时除掉一维的盐并可以获得抗体药物各峰的分子量和相应糖型修饰。该方法适用于抗体药物研发的单克隆筛选及后续稳定性研究质控中。

参考文献：

[1] Koen Sandra,Mieke Steenbeke,Isabel Vandenheede,et al.The versatility of heart-cutting and comprehensive two-dimensional liquid chromatography in monoclonal antibody clone selection.Journal of Chromatography A,2017.

[2] Yi Li,Christine Gu,Jason Gruenhagen,et al.A size exclusion-reversed phase two dimensional-liquid chromatography methodology for stability and small molecule related species in antibody drug conjugates. Journal of Chromatography A,2015,81-88.

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