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全柱成像毛细管等电聚焦——高分辨质谱联用技术分析重组人单克隆抗体

阅读:166        发布时间:2021/11/10

全柱成像毛细管等电聚焦——高分辨质谱联用技术(iCIEF-MS)分析重组人单克隆抗体

 

 

张晓夕

全柱成像毛细管等电聚焦(imaged capillary isoelectric focusing, iCIEF)是一种基于蛋白质等电点(isoelectric point, pI)将其分离的技术,在生物制药行业中被广泛应用于电荷变异体的分析。

 

与传统的毛细管等电聚焦(CIEF)技术相比,iCIEF具有方法开发更快(每个样品仅需10~15min),灵敏度更高,pI值相近的电荷变异体分离更好(分离精度0.01pI),仪器平台稳定性好以及高分析通量等优点。

 

 

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1 iCIEF分离及UV检测原理

 

虽然iCIEF平台可以将常见的生物治疗产品,如单抗、融合蛋白等按照其等电点进行分离,但受其检测手段的局限性,无法得到更为全面深入的蛋白表征信息。2021年6月,赛默飞世尔科技宣布了与Advanced Electrophoresis Solutions Ltd(AES)的合作, 通过将AES的CEInfinite iCIEF平台与赛默飞的高分辨质谱平台联用,对iCIEF分离的电荷变异体进行表征,从而实现对生物治疗产品更加深入的理解。

 

 

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2 CEInfinite iCIEF平台

 

今年9月,来自丹麦Symphogen 的首xi科学家Dan Bach Kristensen在CE Pharm 2021会议上以视频形式介绍了iCIEF-MS联用的最新成果。Dan在报告中提到,使用质谱对单克隆抗体进行分子量分析,样品前处理步骤简单,且Orbitrap高分辨质谱平台的高分辨率和高灵敏度等优点可以提供足够多的信息,帮助科研人员从完整分子量层面对产品进行监控。

通过将不同原理的液相分离技术,如SEC/CIEX/Protein A/RPLC分别与质谱串联,可以将单克隆抗体的不同类型变异体进行分离,随后得到各个变异体的分子量信息。

Dan在他的演讲中举了一个使用iCIEF-MS联用对参比品(-80℃保存)和实验品(48个月,5℃保存)进行对比的示例。通过观察iCIEF-UV图谱,发现相较于参比品,实验品的酸/碱峰均有一定比例的上升。进一步通过质谱数据确认导致酸/碱峰比例增加的具体修饰类型,发现对于碱峰,Orbitrap高分辨质谱的高分辨率和高灵敏度等优点可以最大限度的减少相邻质谱峰的重叠,从而提供更加可信的鉴定结果。最终,通过质谱测定的完整分子量结果,可以得出的结论是实验品中与稳定性相关的产品属性含量上升,而与质量相关的产品属性变化不大-这与科研人员的预期相符。

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