一、支原体污染检测

1.     支原体检测方法概述

支原体污染严重干扰细胞实验结果，检测有无支原体污染的方法较多，可以根据自身实验室条件、检测方法便捷性等作出选择。

= 1 \* GB3 ①电子显微镜，相差显微境观察。用扫描电镜或透射电镜，直观观察支原体形态。或者在细胞培养瓶内预置盖玻片，接种细胞在盖玻片上，培养24小时后取出用油镜观察。如有支原体，因支原体与细胞在不同平面，可发现支原体呈现暗色颗粒装。缺点：设备要求严格，检测成本高，不适合普通实验室日常常规检测。

= 3 \* GB3 ③DNA荧光染色法，利用支原体没有细胞膜（壁）的特性，用荧光染料Hoechst 33258染色， Hoechst 33258能与支原体DNA结合着色，在荧光显微镜下观察，呈现绿色小点。缺点：灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染。

= 4 \* GB3 ④培养法，用支原体培养基大量增殖支原体，是相对可靠的支原体检测技术。缺点：耗时长，需要数周时间才能得到结果，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外，该方法不能检测猪鼻支原体，因为猪鼻支原体不能在固体培养基上形成可见的菌落，猪鼻支原体（M.Hyorhinis）约占所有支原体污染的20-50%。

= 5 \* GB3 ⑤PCR法，提取细胞培养液，提取支原体，制备样品，根据支原体高度保守的16SrRNA序列设计引物（避免真核细胞或细菌DNA干扰），设置阴性，阳性对照，扩增产物经电泳后成像观察，可识别已发现的几乎全部100余种支原体。

= 6 \* GB3 ⑥Quick Cell快速检测法，拓扑酶环化支原体DNA，在根据高保守区设计的引物引导下，采用特殊等温DNA扩增酶，61℃条件下，连续滚环式扩增支原体DNA 60分钟，根据有无支原体污染，随着扩增进程可目视实验结果。

= 7 \* GB3 ⑦化学发光法，裂解支原体后，有底物情况下，支原体特异性的酶，能将ADP转化成ATP。ATP参与荧光素酶（Luciferase）催化底物荧光素（Luciferin）产生光的过程，所以可以通过催化底物荧光素导致的生物发光（Bioluminescence）信号来判别支原体DNA存在与否。

综上所述，在多种支原体检测方法中，受实验条件、实验时长、便捷性等因素限制， = 1 \* GB3 ①- = 4 \* GB3 ④仅在很少情况下得到应用。实际科研工作中，应用的是 = 5 \* GB3 ⑤ PCR支原体检测法； = 6 \* GB3 ⑥Quick Cell快速支原体检测法； = 7 \* GB3 ⑦化学发光支原体检测法。

2.     几种zui常用支原体检测方法比较

检测方法	Quick Cell快速检测法	化学发光法	PCR法
检测原理	环化DNA等温连续扩增	支原体特异性酶检测	根据支原体DNA序列设计引物进行PCR扩增
实验条件	恒温水浴或PCR仪	-80℃超低温冰箱，多功能酶标仪或发光检测仪	常规PCR仪，电泳仪，成像系统
灵敏度	比PCR法高1-2个数量级	与PCR法相当	较灵敏
检测时长	1小时	25分钟	2-3小时
定性/定量	定性	定性，半定量	定性，半定量
污染 假阳性率	低	低	高
引物 假阳性率	零	零	高
样品制备	直接取上清，不需制备	需要样品制备	离心
检出 正确率	>99%	>99.9%	>80%
综合评价	1）简便、快速，任何实验室均可操作；2）扩增不受细胞代谢产物影响，高准确率	1）快速，准确；2）有特定设备要求，物流储存条件高。	1）较高的检出准确率；2）PCR反应易受培养基成分抑制，产生假阴性；3）需制备样品。
代表性 产品	Quick Cell 快速支原体检测（李记生物, CAT:C4056L1060） *本产品由细胞专家李记生物*研发	Quick Cell 支原体发光法检测试剂盒（李记生物,CAT:C4056L1065） MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (Lonza, CAT: LT07-710)	Quick Cell 支原体PCR检测试剂盒（李记生物,货号: C4056L1062） Lookout Mycoplasma Detection Kit.（Sigma货号:MP0035）

3.     支原体检测策略及方法选择

①单个方法独立检测支原体（正确检出率80%-99.9%）

就单个检测方法及原理而言，“化学发光法”拥有zui高的正确检出率（99.9%），用时zui短，应为方法。可选产品为Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (CAT:C4056L1065，价格：约9800元/100次），或李记生物公司的“Quick Cell 支原体发光法检测试剂盒（CAT:C4056L1065，价格：1250元/50次）”。

若受实验室条件所限没有配备化学发光检测仪，或多功能酶标仪，建议选择“Quick Cell快速检测法”，该方法1小时出结果，避免了PCR法因细胞代谢产物抑制PCR反应导致的假阴性出现，正确检出率大于99%，对设备几乎无要求，可目测结果。产品可选李记生物公司的“Quick Cell支原体快速检测试剂盒（CAT:C4056L1060，价格：1250元/50次）”。

 ②多原理支原体检测策略

市场在售的所有支原体检测试剂盒，目前没有一种可以检出全部可能的支原体污染，如果从事细胞治疗、进行干细胞培养、生产血清、胰酶、培养液工作的科研人员，强烈建议选择两种以上检测方法，确保支原体正确检出率达到*，避免关键实验不必要的损失。

细胞培养支原体污染是个普遍性问题，污染来源很多，根据国外生物实验室的规范做法，实验室的支原体检测要定期进行，一般一个月做一次支原体检测，可以*时间确定支原体污染情况，显著降低或避免支原体污染对细胞培养相关实验的影响。

二、支原体污染去除

1.     支原体污染预防

根据可能的支原体污染来源，在体外细胞培养过程中，要严格控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和实验器材、耗材要保证无菌；在不影响实验结果的前提下，可在细胞培养基中加入适量的特定抗生素；发现支原体污染后，要清除支原体，防微杜渐。

2.     支原体污染的去除及预防

因为支原体没有细胞壁，一般用于细胞壁合成的抗生素对支原体没有作用，如青霉素、万古霉素多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍没什么效果。对支原体zui有抑制活性及常用于支原体去除的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮。在低浓度时，这些抗生素不会产生耐药性，且对哺乳动物细胞的毒性较小。四环素和大环内酯能结合30S和50S核糖体亚基，从而抑制支原体蛋白质合成，喹诺酮抑制DNA旋转酶。因此可以在细菌DNA复制及蛋白质合成两个层面上抑制细菌生长，明显增强除菌效果。

3.      支原体去除试剂选择

选择支原体去除试剂需要注意几个关键几点： ①细胞毒性小，毒性大的试剂在去除支原体的同时，会杀死细胞；②支原体去除效果，选择广谱试剂，去除多种支原体，以及细菌，真菌等； ③操作简便，没有二次污染；要考虑操作使用是否方便，因为如果使用起来比较麻烦，首先是费时费力，另外可能会带来二次污染。目前市场上有多种支原体去除&预防试剂可选。包括李记生物的Quick Cell支原体预防/去除试剂，美国GenDEPOT公司的Cellmaxin，罗氏公司的BM-Cyclin，Biolnd的BIOMYC-1,BIOMYC-2,BIOMYC-3，以及Invivogen 公司的Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment 等。

 Quick Cell支原体预防及去除试剂和Cellmaxin都是从蛋白和DNA两个层面去除支原体，抗菌谱广。不同在于Quick Cell的使用者可以灵活选择单独或联合使用两种成分，分别或同时在蛋白或DNA层面去除支原体污染，细胞毒性更小。作用周期1-2周，支原体去除率大于92%。去除预防兼顾

BM-Cyclin包含泰妙菌素（BM-Cyclin 1）和二甲胺四环素（BM-Cyclin 2）两种成分，抑制支原体及细菌生长，去除培养细胞中已感染的支原体。适用于多种培养细胞，无明显副作用，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。BM-Cyclin需联合使用，作用周期2周，可消除80%以上的支原体。不确定能否预防。

BIOMYC-1基于抗生素泰妙菌素，由真菌pleurotus mutilus 产生。 BIOMYC-2基于二甲胺四环素，四环素衍生物。此两种抗生素溶液通常按先后联合使用2－3次循环约一周以上，可取得良好的效果。BIOMYC-3 基于抗生素环丙沙星，属于氟喹酮类。许多支原体被证明对BIOMYC-3敏感，需要根据支原体种类使用。处理周期2周，能去除90%的支原体。是否可以预防支原体目前还不能确定。

Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment也是两种抗生素的混合物，包含两个针对支原体的有效成分，作用于蛋白质合成和DNA复制阶段，对许多细菌和真核细胞则没有影响。作用周期2周，去除效率未知。有两个浓度包装，去除用高浓度，预防用低浓度。