本生带您了解、小分子化合物(荧光染料)

　　本生带您了解、小分子化合物(荧光染料)

　　荧光染料是指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。由于灵敏度高，操作方便，逐渐取代了放射性同位素作为检测标记，其广泛应用于荧光免疫，细胞染色等。荧光染料即可以单独使用，也可以组合成复合荧光染料使用，用于染色体分析、细胞周期、细胞凋亡等相关研究。另有很多核酸染料在多色染色系统中是非常有用的复染剂，可作为背景对照，标记细胞核使细胞内结构的空间关系一目了然。

　　常用核酸染料

　　DAPI是结合富含A-T碱基对DNA序列的荧光染料。DAPI是一种能够与DNA中大部分A，T碱基相互结合的荧光染料﹐常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜﹐它可以用于活细胞和固定细胞的染色。当DAPI与双链DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm。DAPI的发射光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白GFP或Texas Red染剂(红色荧光染剂)的发射波长仅有少部分重叠，可以利用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。

　　一般的，用于细胞核染色时，推荐的DAPI工作浓度为0.5-10μg/mL。

　　Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，它在嵌入双链 DNA后释放强烈的蓝色荧光，对细胞的毒性较低。Hoechst 33342染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33342也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。Hoechst 33342的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm;Hoechst 33342和双链DNA结合后，最大激发波长为350nm，最大发射波长为461nm。

　　细胞凋亡检测

　　JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm的理想荧光探针。在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时;JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降,同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

　　活性氧检测

　　DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

　　ROS荧光探针-DHE

　　DHE是一种可渗透细胞的蓝色荧光探针，是过氧化物指示剂，可用于检测细胞内superoxide radical anion，能有效地检测活性氧类。这种染料可以自由地进入细胞中，脱氢后成为Ethidium。DHE可以直接用于活细胞的标记。DHE被活细胞摄入后，可以在细胞内的超氧化物阴离子作用下脱氢，产生Ethidium。Ethidium可以和RNA或DNA结合产生红色荧光。当细胞内的超氧化物阴离子水平较高时，产生的Ethidium较多，红色荧光就较强，反之则较弱。DHE本身为蓝色荧光，最大激发波长为370nm，最大发射波长为420nm，脱氢后和RNA或DNA结合产生红色荧光，最大激发波长为300nm，最大发射波长为610nm，实际观察时也可以使用535nm作为激发波长。

　　一般的，用于细胞内超氧化物阴离子检测时，DHE的常用浓度为1-10μM。

　　钙离子浓度检测

　　Fluo-3 AM是常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。它穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成 Fluo-3，从而被滞留在细胞内，Fluo-3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525-530nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。

　　其他染料

　　尼罗红是一种亲脂性的恶嗪类荧光染料，与脂类物质结合并发出荧光，在激发波长530nm激发下，显示强烈桔红色荧光。常用于检测细胞内脂滴。

　　Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，它穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成Calcein，从而被滞留在细胞内，发出强绿色荧光。Calcein的激发和发射波长分别为490nm和515nm。Calcein-AM和PI经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。

　　FITC是在荧光素的基础上通过化学反应增加(异)硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以和生物活性物质例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物活性物质的荧光标记。FITC能和各种抗体蛋白等物质结合，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可进行定性、定位或定量的检测。

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