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逆转录PCR反应技术与反应体系

2021年10月08日 14:30来源:上海抚生实业有限公司 >>进入该公司展台人气:62


PCR反应需要以双链DNA作为模板,因此最初的PCR反应用于检测目标样本的基因组中是否存在特定的目的片段,但是这种以基因组DNA为模板的PCR反应无法检测目的基因是否在样本中表达,此外由于真核生物的基因中存在内含子,直接通过基因组DNA进行PCR也很难确定样本中是否存在目的基因,针对这一问题,发展出了逆转录PCR的技术。

技术原理

逆转录PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR) 是以mRNA为模板,在逆转录酶作用下合成cDNA,之后再进行PCR的过程。

mRNA逆转录合成cDNA的过程分为两步:

在特定引物的介导下,通过逆转录酶的催化下以mRNA为模版合成互补的cDNA第一链;

升高温度使cDNA第一链与mRNA解离,然后降温,使其与另一引物退火结合,并由DNA聚合酶催化延伸生成cDNA第二链。

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品的分析成为可能,该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

逆转录反应体系

1. RNA模板

通常20μL的逆转录体系,加入总RNA 1μg,如果总RNA加入过多,会导致逆转录不充分。

2. 引物

常用的有随机引物和Oligo(dT)引物:

随机引物会将所有RNA分子均进行逆转录,此时得到的cDNA大部分来源于rRNA,主要在部分mRNA含有逆转录酶终止序列而难以得到其全序列时使用;

Oligo(dT)与真核生物mRNA的Poly(A)区域匹配,可以特异性的对mRNA进行逆转录。

3. 逆转录酶
逆转录过程涉及以RNA为模板合成DNA和以DNA为模板合成互补链的两个过程,目前市场上的逆转录酶都同时具有这些功能,因此只需在反应体系中加入逆转录酶即可,而不需额外加入DNA聚合酶。

4. 4种dNTPs


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