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脑脉泰胶囊对外周神经元损伤模型斑马鱼神经再生的影响丨环特生物斑马鱼研究

2021年11月25日 09:57来源:杭州环特生物科技股份有限公司 >>进入该公司展台人气:44


核心摘要

目的:探讨脑脉泰胶囊治疗脑梗死的可能作用机制。

方法:脑脉泰股囊用超纯水溶解成50、100、 250、500、1000、1500μg/ ml6个浓度,均分别处理30尾野生型AB系斑马鱼24h后,统计各组斑马鱼死亡数量,绘制浓度效应曲线,并计算非致死浓度,筛选实验药物浓度。取受精后1天运动神经元转基因荧光斑马鱼,分为空白对照组、模型组、阳性对照组和脑脉泰肢囊高、中、低剂量组,每组30尾。除空白对照组外,其余各组斑马鱼用1.5%乙醇诱导处理斑马鱼48h建立斑马鱼外周运动神经元损伤模型。造模结束后,阳性对照组给予L-甲状腺素钠0.08μmol/ L, 空白对照组和模型组给予养鱼用水,脑脉泰胶囊低、中、 高剂量组分别给予筛选浓度的脑脉泰胶囊处理24h。药物处理结束后,利用图像处理软件测量外周运动神经元的长度,计算促神经再生率。

结果:脑脉泰胶囊浓度在50、100μg/ml时,斑马鱼无死亡;浓度为 250μg/ml时斑马鱼开始出现死亡,根据浓度效应曲线得出脑脉泰肢囊非致死浓度为170μg/ml, 故本研 究选取17、57、170μg/ml为脑脉泰胶囊低、中、高剂量组干预浓度。与空白对照组比较,模型组斑马鱼外周运动神经元长度显著缩短(P<0.01);与模型组比较,阳性对照组和脑脉泰胶囊低、 中、 高剂量组斑马鱼外周运动神经元长度增加(P<0.01) ; 与阳性对照组比较,脑脉泰肢囊中、高剂量组斑马鱼外周运动神经元长度差异无统计学意义(P>0. 05 ) , 而脑脉泰胶囊低剂量组斑马鱼外周运动神经元长度降低(P<0.01)。阳性对照组和脑脉泰胶囊低、中、高组促神经再生率分别为31%、17% 、29% 、30% 。

结论:脑脉泰胶囊对外周神经元具有促神经再生作用,可能为其治疗脑梗死作用机制之一。

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● 综述

脑梗死又称缺血性卒中,中医学称之为卒中或 中风,是指由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍,出现脑组织缺血、缺氧,发生病变坏死 ,进而产生临床上对应的神经功能缺失表现。脑梗死恢复期是急性期到后遗症期的过渡阶段,此阶段留有不同程度的神经功能缺损,且有复发可能 ,是决定患者预后及生活能力的关键时期,也是临床治疗的重要时期。

脑脉泰胶囊具有益气活血、熄风豁痰的功效,可用于脑梗死恢复期患者。既往研究表明,脑脉泰胶囊治疗缺血性脑梗死有效率可达96. 79%,可显著改善脑梗死患者的神经功能和日常生活能力评分。

斑马鱼是一种与人类同源性较高的脊椎动物,具有容易获得、生长快速、给药方便、胚胎透明等特性,在构建中枢神经系统疾病模型方面具有重要的效用,是研究中枢神经系统疾病和药物研发的重要工具。本研究通过建立斑马鱼外周运动神经元损伤模型,观察脑脉泰胶囊的干预作用,为进一步阐明脑脉泰胶囊改善脑梗死患者神经功能的可能机制提供数据支持。本研究符合实验动物伦理学相关要求。

● 实验方法

1. 脑脉泰肢囊非致死浓度的筛选

      脑脉泰胶囊用超纯水溶解,通过预实验结果设 置 6 个 初 始 检 测 浓度 ,分别为50、100、250、500、1000、1500μg/ml,每个浓度均处理30尾野生型AB系斑马鱼。同时设置空白对照,给予养鱼用水。处理24h后,统计各组的斑马鱼死亡数量,绘制上佳的浓度效应曲线 ,并计算非致死浓度。

2. 脑脉泰肢囊对外周神经损伤斑马鱼模型的影响

取1dpf运动神经元转基因荧光斑马鱼,实验分为空白对照组、模型组、阳性对照组和脑脉泰胶囊高、中、低剂量组,每组30尾。除空白对照组外,其余各组斑马鱼用1.5%乙醇诱导处理斑马鱼48h,建立斑马鱼外周运动神经元损伤模型。造模结束后,阳性对照组给予超纯水溶L-甲状腺素 钠0.08μg/ml,空白对照组和模型组给予养鱼用水,脑脉泰胶囊各剂量组分别给予筛选浓度的脑脉泰胶囊处理24h。药物处理结束后,按简单随机抽 样法每组随机挑选10尾斑马鱼,在荧光显微镜下拍照,进行图像分析,定量外周运动神经元的长度(L),计算促神经再生率。

● 实验结果

1. 脑脉泰胶囊非致死浓度筛选结果

表1示,脑脉泰胶囊浓度在50、100μg/ml时 ,斑马鱼无死亡;浓度为 250μg/ml时,斑马鱼开始出现死亡,随着浓度的增加斑马鱼死亡率逐渐升高。利用软件模拟曲线(图1) 求得脑脉泰胶囊非致死浓度为170μg/ml,故本研究选取17、57和170μg/ml为脑脉泰胶囊低、中、 高剂量组干预浓度。

图 1 脑脉泰胶囊干预斑马鱼的浓度-致死曲线

2、各组斑马鱼外周运动神经元长度比较

表2示 ,与空白对照组比较,其余各组斑马鱼外周运动神经元长度显著缩短(P<0.01) ; 与模型组比较,阳性对照组和脑脉泰胶囊低、中 、高剂 量组斑马鱼外周运动神经元长度增加(P<0.01); 与阳性对照组比较,脑脉泰胶囊中、高剂量组斑马鱼外周运动神经元长度差异无统计意义(P>0. 05),而脑脉泰胶囊低剂量组斑马鱼外周运动神经元长度缩短(P<0.01);与脑脉泰胶囊低剂量组比较,脑脉泰胶囊中、高剂量组斑马鱼外周运动神经元长度增加(P<0.01) ; 脑脉泰胶囊中、高 剂量组斑马鱼外周运动神经元长度差异无统计学意义(P>0. 05)。

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● 讨论

中医药治疗脑梗死恢复期具有一定的优势,治则以补气血、强肝肾 、活血化瘀为主。脑脉泰胶囊以红参大补元气,补脾益肺;三七补益气血, 化瘀通脉;当归、丹参、鸡血藤、红花、银杏叶活 血化疲;菊花、石决明 、何首乌、石菖蒲滋阴潜阳,平肝熄风,豁痰开窍;诸药合用可益气活血、 化瘀通络、清心安神。

药效学研究表明,脑脉泰胶囊可通过提高脑组织神经生长因子和降低胶质纤维 酸性蛋白表达来改善慢性脑缺血大鼠的认知功能,还能增加实验大鼠海马局部脑血流量,抑制海马神经细胞凋亡。目前斑马鱼模型在帕金森综合征、抑郁症、癫痫、阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病研究中得到了广泛应用,在神经系统组织器官的再生学研究中已显示出独特的优势。西医治疗神经损伤疾病 主要是使用营养神经药物,但其作用机制单一,疗效仍不够理想。L-甲状腺素钠具有促进神经生长发育的功能,通常作为该模 型的阳性对照药物。

本研究结果显示,脑脉泰胶囊中、高剂量组斑马鱼外周运动神经元长度与阳性对照组差异无统计学意义,但明显高于脑脉泰胶囊低剂量组,而脑脉泰胶囊低、中、高剂量组促神经再生率分别为17%、29%、30%, 说明脑脉泰胶囊对外周运动神经元损伤的斑马鱼促神经再生作用呈浓度依赖性, 且中、高剂量的脑脉泰胶囊与阳性对照药L-甲状腺素钠效果相当,具有神经损伤的保护作用。

由于复方中成药的成分复杂,本次实验显示脑脉泰胶囊对斑马鱼的非致死浓度为170μg/ml,限制了更高浓度实验的选择,未来将通过分离纯化进一步 提高实验的药物浓度,明确起效的药用部位,并选 择更高等级的实验动物验证其作用,为脑脉泰胶囊改善脑梗死患者神经功能的机理研究提供依据。

作者:钟小清,朱晓宇,徐懿乔,何胜旭

本文发表于:《中医杂志》2021年6月第62卷第11期


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