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​提高RT-PCR反应体系的灵敏度方法

2022年06月21日 11:52来源:上海抚生实业有限公司 >>进入该公司展台人气:143


1、分离高质量RNA

成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂如EDTA或SDS等,以及尽可能减少基因组DNA污染。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的大值。

2、使用无RNaseH活性的逆转录酶
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。不管是M-MLV还是AMV,在本身的聚合酶活性之外,都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链,并降解RNA:DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。

3、提高逆转录保温温度
较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开,增加了反应的产量。对于多数RNA模板,在没有缓冲液或盐的条件下,将RNA和引物在65℃保温,然后迅速置于冰上冷却,可以消除大多数二级结构,从而使引物可以结合。

4、促进逆转录的添加剂
包括甘油和DMSO在内的添加剂加到*链合成反应中,可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构,多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或M-MLV的活性。AMV也可以耐受多20%的甘油而不降低活性。

5、RNaseH处理
在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板,在cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合,在这种情况下,RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时,RNaseH处理是必需的,比如低拷贝的tuberous scherosisⅡ。对这种困难模板,RNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应,RNaseH处理是可选的,因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA:DNA复合物中的RNA水解掉。

6、小量RNA检测方法的提高
当仅有小量RNA时,RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。对于小于50mg的组织106个培养细胞的样品,无RNase糖元的建议浓度为250μg/ml。在使用SuperScriptⅡ的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度,而且对于小量RNA,减少SuperScriptⅡ的量并加40单位的RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元,仍然建议在使用SuperScriptⅡ进行逆转录反应时加入BSA或RNase抑制剂。

7、减少基因组DNA污染
RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中有基因组DNA污染,可以在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65℃保温10分钟以终止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合镁离子,防止高温时所发生的依赖于镁离子的DNA水解。为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开,可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于污染的基因组DNA的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验,以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。

 

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