ELISA夹心法实验步骤和注意事项

　　ELISA夹心法实验步骤和注意事项

以下是本生ELISA夹心法实验的标准化操作流程及关键注意事项：

一、实验步骤详解

抗体包被‌

用pH9.5碳酸盐缓冲液稀释捕获抗体至1-10μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被过夜或37℃孵育2小时

弃液后使用含0.1%吐温的PBS洗板3次，每次浸泡3分钟并拍干

封闭非特异性位点‌

加入200μl/孔封闭液(3% BSA或5%脱脂牛奶)，37℃孵育1小时

重复洗涤步骤，确保去除未结合封闭剂

样本孵育‌

加入100μl待测样本/标准品，37℃孵育1小时，同时设置空白孔与对照孔

标准品需梯度稀释(建议2倍系列稀释)，样本浓度过高时需预稀释

酶标抗体结合‌

洗涤后加入100μl HRP标记检测抗体，37℃孵育1小时

严格洗板5次以去除游离抗体(关键步骤)

显色与终止‌

每孔加入90-100μl TMB底物，37℃避光显色15分钟(观察标准孔梯度)

加入50μl 2M硫酸终止反应，颜色由蓝变黄

结果读取‌

终止后10分钟内用酶标仪测定450nm吸光度(参考波长630nm)

　　二、关键注意事项

样本处理‌

血清样本需6小时内分离，避免溶血(血红蛋白干扰显色)

冻存样本避免反复冻融，检测前需离心去除沉淀

试剂控制‌

所有试剂使用前平衡至室温(约30分钟)，但酶标抗体需避光

不同批号试剂禁止混用，浓缩洗涤液结晶需37℃溶解

操作规范‌

加样时枪头勿触碰孔壁，避免气泡产生

洗板后需拍干(吸水纸需及时更换)，但避免过度干燥

质量控制‌

阳性对照OD值应≥0.8，阴性对照OD值≤0.2(否则实验无效)

建议样本做复孔检测，CV值应控制在15%以内

三、异常处理建议

高本底值‌：增加封闭液浓度(5% BSA)或延长封闭时间至2小时

显色异常‌：检查酶标抗体活性及底物是否失效，显色时间不超过30分钟

附：实验流程时序图

A[包被抗体] --> B[封闭]

B --> C[加样本]

C --> D[酶标抗体]

D --> E[显色]

E --> F[终止测定]

通过规范操作和严格质控，可确保检测灵敏度达到pg级别。

注：以上资料仅供参考，如需具体品牌产品的完整说明，建议提供货号或厂商名称以便进一步确认。

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