小鼠细胞实验培养步骤

      小鼠细胞常用的分离方法有两种，一种是贴块法，一种是消化法，这两种方法都可以用于分离和培养原代细胞。

一、实验分离和培养步骤

1. 小鼠颈椎脱臼处死后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。

2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。

3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后立即转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。

4. 清洗完成后，用剪刀镊子配合除去主动脉弓和心房组织，仅保留心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。

5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。

A. 贴块法

6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3-5 min。

7. 消化完成后，添加数毫升FBS终止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1伺次后，用200 ul吸头将组织块平均接种于T-25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2-4h。

8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触所有的组织块。

9. 之后放入培养箱中继续培养，一般2-4天后成纤维细胞会从组织块周围爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。

B. 消化法

6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上层混悬液弃去。

7. 余下组织加入混合消化液10 ml，37℃水浴震荡消化10 min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS终止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至组织块消化。

8. 按1∶1加入含血清的培养基，中止酶反应，悬液过200目网筛去除较大的组织块。

9. 收集全部中止后的消化液于离心管中，300g，离心10 min，弃去上清，加入培养液重悬细胞后计活细胞数。

10. 调整细胞密度以1× 106个/ml 接种入的T-25培养瓶中，每瓶添加2 ml细胞悬液。

11. 培养瓶放置于37℃，5% 二氧化碳培养箱中静置40min后，吸弃上清液以去除未贴壁的非成纤维细胞和死细胞，再添加5 ml培养基继续培养。

二、传代步骤

如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

三 、复苏步骤

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

四 、冻存步骤

待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例：

1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml培养基终止消化，可使用血球计数板计数。 

2. 1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X10^6个细胞冻存。

3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。