RT-qPCR实验具体操作过程

qPCR: Quantitative Real-time PCR,中文名是 实时荧光定量PCR。qPCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

RT-qPCR 是一种用于实时扩增和检测特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物学技术。该方法利用荧光染料或探针，当与扩增的 DNA 或 RNA 分子结合时会发出信号，从而可以对目标序列进行量化。RT-qPCR 通常用于基因表达分析、病毒载量定量和基因突变检测等应用。

RT-qPCR原理的三个主要步骤：

1 反转录：

· 使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA。

· 该步骤将RNA模板转化为更稳定且可扩增的DNA形式。

· 反转录过程中使用特定引物。

2 PCR扩增：

· 使用特定引物对cDNA进行PCR扩增，这些引物环绕目标区域。

· PCR是一个循环过程，呈指数级扩增DNA模板的数量。

· PCR反应中包含荧光染料或探针，它们结合到扩增的DNA序列上并发出荧光信号。

3 荧光实时检测：

· 使用实时PCR仪器实时监测荧光信号。

· 荧光的数量与每个PCR循环中扩增的DNA数量成比例。

· 使用专业软件分析数据以确定循环阈值（Ct）值，该值表示荧光信号达到特定阈值水平所需的循环数。Ct值用于计算原始样品中存在的目标DNA量，从而允许进行基因表达或病毒载量等定量分析。

实验步骤：

一、RNA提取：

RNA的提取是参照全式金生物的Transzol up提取试剂盒完成的。

1、离心机4℃预冷，准备试剂：氯仿、异内醇、75%乙醇（用DEPC水配制）、无RNase的水或DEPC水、无酶吸头及试管，戴口罩、帽子、无粉乳胶手套；

2、取出转染建模成功24h后的细胞，吸弃培养液，用1×PBS清洗1次；

3、每10cm2生长的细胞加入1mL的Transzol Up, 放置片刻后使用移液枪吹打细胞使其全脱落；

4、用移液枪反复吹吸裂解液直至无明显沉淀，将裂解液全部转移至标记好的1.5mL EP管中，室温静置5min；

5、往每个EP管中加0.2mL氯仿（Transzol Up体积的1/5），混匀振荡30s，室温静置3min；

6、4℃条件下10000g离心15min，离心后RNA主要分布在上层水相中，体积约50%；

7、转移上层水相于新的EP管中（约400μL，注意不要吸取到下层），每管加入0.5mL异丙醇 （Transzol Up体积的1/2），颠倒混匀，室温孵育10min；

8、4℃下10000g离心10min后在管侧和管底形成胶状沉淀，吸弃上清，加1mL 75%乙醇吹悬沉淀；

9、4℃下7500g离心5min后弃上清，尽量吸净，室温晾干沉淀5min，依细胞量加入30~100μL的RNA溶解液；

10、55℃~60℃金属浴10min，-80℃冰箱保存备用。

二、cDNA合成：见上文

三、qPCR：

在ABI荧光定量PCR仪专用96孔板中建立qPCR反应体系，反应程序为两步法。反应程序为两步法如下表：

4、RT-qPCR统计：每个基因在不同组别中的表达在获得3个重复的Ct值后，从ABI系统中拷贝原始数据，挑出“Ct SD”值大于0.5的组别（需重新实验），求出各个组的管家基因GAPDH的均值（一般相差1个Ct值以内），再依次求出实验组和对照组与各自的GAPDH之间的Ct差值，即得到第一个ΔCt，随后求出实验组ΔCt和对照组ΔCt的差值，即可得到第二个ΔCt（ΔΔCt），最后使用2 -ΔΔCt法求出实验组相对于对照组的Ct值变化倍数（实验组2 -ΔΔCt/对照组2 -ΔΔCt=实验组2 -ΔΔCt/2 0=实验组2 -ΔΔCt）。将3组实验组数据导入Graphpad 9.0，输入对照组数据为1，使用Student's t或ANOVA进行假设检验，p<0.05被认为有统计学差异。