无内毒素质粒大提试剂盒
EndoFree Plasmid Maxi Kit
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简介：
纯化得到至多500 μg无内毒素高转染级纯质粒或柯斯质粒DNA
1.纯化得到的DNA内毒素低于0.1 EU/µg
2.纯化流程快，同时去除内毒素
3.获得高产量的高拷贝质粒DNA
4.使用LyseBlue，获得*的裂解和高产量的DNA
EndoFree Plasmid Kits基于阴离子交换技术，可快速制备不含内毒素的质粒DNA。QIAfilter Cartridges通过过滤快速澄清裂解液，DNA产量至多500 μg（Maxi）、2.5 mg（Mega）和10 mg（Giga）。制备的DNA纯度超过两次CsCl梯度离心法所得DNA的纯度，非常适合超转染级纯的应用。
详细信息：
性能
EndoFree Plasmid Maxi Kit将高效的内毒素去除步骤整合到质粒纯化过程中，不需要额外步骤，也不需用亲和柱去除脂多糖。通过QIAfilter Maxi Cartridge过滤细菌裂解液，通过重力流QIAGEN-tip 500阴离子交换柱纯化质粒DNA。100–250 ml培养菌液至多可纯化500 µg DNA。（培养量取决于质粒拷贝数量、插入片段大小、宿主菌和培养介质。）纯化的DNA无内毒素（<0.1 EU/µg DNA）。
EndoFree Plasmid Kits去除细菌在裂解过程中释放的内毒素，内毒素会影响原代细胞和敏感培养细胞的DNA转染。从EndoFree Plasmid Kits得到的无内毒素DNA高度适用于可重复且结果可靠的转染（参见Plasmid purification method versus transfection efficiency和Plasmid purity versus transfection efficiency 及表"Endotoxin levels in plasmidpreparations"和"EndoFree DNA yields high transfection efficiencieswith primary cells"）。QIAGEN超纯无内毒素DNA也适用于基因治疗研究和其他敏感应用。
质粒制备中的内毒素水平*
| 质粒准备方法 | 内毒素(EU†/µg DNA) | 平均转染效率‡ |
| EndoFree Plasmid Kit | 0.1 | 154% |
| QIAGEN Plasmid Kit | 9.3 | 100% |
| 2x CsCl | 2.6 | 99% |
| Silica-gel slurry | 1230.0 | 24% |
* 宿主菌：大肠杆菌DH5α 质粒：pRSVcat.
† 1 ng LPS = 1.8 EU.
‡ 根据表中数据计算 Plasmid purificationmethod versus transfection efficiency.
无内毒素DNA配合原代细胞得到高转染率*
| DNA纯化方法 | 转染细胞百分比 |
| EndoFree Plasmid Kit | 21.0% ± 0.93 |
| QIAGEN Plasmid Kit | 8.1% ± 0.57 |
| Silica-gel slurry | 5.2% ± 0.74 |
* 原代兔胃壁细胞转染pEGFP-N2（CLONTECH），pEGFP-N2由所示的方法制备。使用EffecteneTransfection Reagent进行转染。该数据是细胞表达GFP的百分率，由转染48小时后绿色荧光细胞数量确定。转染效率是每种纯化方法制备的超过2个不同的DNA中6–9个复制样本的平均值。（数据由C. Chew andJ. Parente友情提供， Department ofMolecular Medicine and Genetics,
原理
纯化的质粒DNA内毒素污染水平取决于所用的纯化方法（参见"Endotoxin levels in plasmidpreparations"）。硅胶技术纯化的DNA具有非常高的内毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和两次CsCl超速离心可获得相对低水平内毒素的纯DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的内毒素去除步骤，获得<0.1 EU/µg的质粒DNA。
QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊设计的过滤装置，用于代替细菌细胞碱裂解后的离心步骤。QIAfilter Cartridges可*去除SDS沉淀，清除细菌裂解液，相比离心可大量节约时间，减少1小时的质粒纯化时间。QIAfilter Maxi Cartridges在几秒钟内，推动液体通过过滤器，以注射的方式将裂解物清除。
QIAGEN-tips中*的阴离子交换树脂（不提供EndoFree Plasmid Buffer Set）专为核酸纯化而开发。它的分离性能使得DNA纯度与连续两次CsCl梯度离心获得的DNA纯度相当。由重力流驱动并持续运转的预装QIAGEN-tips，zui大限度减少手动制备质粒所需的时间。整个QIAGEN质粒纯化系统不使用有毒物质，如苯酚，氯仿，溴化乙锭和CsCl，zui大限度地减少对用户和环境的危害。
内毒素，又称脂多糖或LPS，是革兰氏阴性菌细胞膜的组成部分，如大肠杆菌（参见Bacterial cell wall）。内毒素在质粒解裂纯化过程中释放，并显著地降低内毒素敏感的细胞株转染效率（参见Plasmid purification method versus transfection efficiency 和Plasmid purity versus transfection efficiency 以及下表"Endotoxin levels in plasmidpreparations" 和"EndoFree DNA yields high transfection efficiencieswith primary cells"）。此外，内毒素与DNA竞争“自由”转染试剂，影响转染实验。内毒素也诱导巨噬细胞和B细胞等免疫细胞中非特异性免疫反应，从而导致转染结果的误读。这些反应包括诱导的蛋白质和脂类，如IL-1和前列腺素的合成。总体而言，内毒素在转染实验装置中是不可控变量，影响结果的可重复性，使它们难以对比、解读。在基因治疗研究中，内毒素可造成内毒素休克综合症和激活补体级联，干扰研究。
操作流程
在碱性条件下，细菌细胞裂解，用QIAfilter Cartridge清除粗裂解物。将Endotoxin Removal Buffer加入到过滤后的裂解液中。冰浴后，将纯净的裂解物上样到阴离子交换柱上，在适当的低盐和pH条件下，质粒DNA选择性结合。用中盐缓冲液清除RNA、蛋白质、代谢产物和其他低分子量杂质，超纯质粒DNA被高盐缓冲液洗脱（参见QIAGEN Plasmid Kit procedures）。DNA由异丙醇脱盐、沉淀并且离心回收。
应用
使用EndoFree Plasmid Kits纯化的DNA适合多种敏感应用，包括：
1.转染，包括原代、敏感以及悬浮细胞
2.基因治疗研究
3.基因沉默
4.显微注射
技术参数：
| 特点 | 参数 |
| Applications | Transfection, gene therapy |
| Culture volume/starting material | 100 µl – 250 ml culture volume |
| Plasmid type | High-copy, low-copy, cosmid DNA |
| Processing | Manual (vacuum) |
| Samples per run; throughput | 1 sample per run |
| Technology | Anion-exchange technology |
| Time per run or prep per run | 150 min |
| Yield | <500 µg |
【公司名称】 广州健仑生物科技有限公司
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