反应五要素:
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则:
①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基,特别是末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
产品名称 | 梭状芽孢杆菌PCR检测试剂盒价格 |
英文名称 | Clostridium estertheticum PCR |
分类 | PCR检测试剂盒 |
特点:
高特异性:与其他病毒无交叉反应,无非特异性扩增;
高灵敏度:检测灵敏度可达10~100;
操作简便:该系列所有试剂均采用相同的体系和条件,可同时进行多个检测;
高通量:多种双重PCR检测以及三重PCR检测试剂盒。
样品 DNA 的制备:
1.用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。 本试剂盒免费赠送 15 次 DNA 病毒裂解液试用装(一管式病毒 DNAout 的成分)。
稀释阳性对照(以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的长为 86bp 的 DNA 片段作为阳性对照。
2.标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
3.用带芯枪头分别加入 45 μL 模板稀释液(用带芯枪头,下同)。
4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1 分钟,得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。5.换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6.换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7.换枪头,在 4 号管中加 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中,得1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。8.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
使用及效果:
PCR反应特点
(1) 特异性强
PCR反应的特异性决定因素为:
①引物与模板DNA特异正确的结合;
②碱基配对原则;
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。
(2) 灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中zui小检出率为3个细菌。
(3) 简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。
(4) 对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活PCR技术概论。
RAB27B/C25KG抗體,兔多抗6681-18-1C20H24ClNO4Magnoflorine chloride≥98%ELISA 氯化木兰花碱
ELISAKitforHumanInterleukin-1beta891986 20mg Dacarbazine 15.6-1000 pg/ml达卡巴
TTC糖琼脂250g 500g 1kg 250gPEG6000 聚乙二
人心钠肽(ANP)ELISA试剂盒5mg 0.156-10 ng/mLCENTAUREIN(RG)
碳酸氢钠琼脂基础137-18371炭疽杆菌的荚膜培养56390-09-1/ C50-07-7/25316-40-9
ELISAKitforHumanSerologicallydefinedcoloncancerantigen35mg 1.56-100 ng/mL二氢醉椒素 DIHYDROKAVAIN(P)
小鼠牙髓干细胞 20mg HPLC≥98%Darutigenol用于含量测定5 x 10^5 cells/T25培养瓶豯莶精;莶精
PRLR/Prolactinreceptor抗體,兔單抗5mgELISA FCM IF ICC/IF 蒜氨酸 ALLIIN(AS)
雄二(ANDRO)ELISA试剂盒546-97-4 20mgColumbin HPLC≥98% 0.312-20 ng/mL古伦宾
IL6ST/gp130/CD130抗體,鼠單抗31008-19-2HPLC≥98%A036620mg/支ELISA 辛夷脂素
ELISAKitforHumanCarbohydrateAntigen5055916-51-3 20mg Polyphyllin VI 1.56-100 ng/mL重楼皂苷Ⅵ
IFNbeta抗體,兔單抗33457-62-4C19H18OAlnustone HPLC≥98%ELISA 桤木
人胃泌素释放多肽(GRP)ELISA试剂盒174972-79-310mg Parishin B 15.6-1000 pg/mL巴利森苷B
Endo培养基/EndoAgarASBC3015大肠菌群的检测5-羧基荧光素(单一化合物)
ELISAKitforHumanSerine/threonine-proteinkinasemTOR100G 78-5000 pg/mL2-溴代异丁酰溴 2-Bromoisobutyryl Bromide >98.0%(GC)
结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)乙型肝炎病毒前S1抗原检测试剂盒 5kg康珠生物乙型肝炎病毒前S1抗原检测试剂盒
梭状芽孢杆菌PCR检测试剂盒价格Hydrindantin dihydrate 二水还原茚三 5g TGE培养基
二氢辣椒素 DIHYDROCAPSAICIN(P) 10mg ELISAKitforHumanProteinS100-A8
人参皂苷Rh2 HPLC≥98% A0241 CD5抗體,兔單抗 20mg/支
荷包牡丹碱 10mg Dicentrine 人的谷胱甘肽S转移酶ω1(GSTO1)ELISA试剂盒
川陈皮素;川皮亭;蜜橘黄素 HPLC≥98% Nobiletin 小鼠胚胎干细胞,E14细胞 用于含量测定
风信子素 20mg 2-(1-Ethoxyethoxy)ethyl)benzene 人细胞分裂周期因子42(CDC42)ELISA试剂盒
AFZELIN(KAEMPFEROL-3-O-alpha-L-RHAMNOPYRANOSIDE)(P) 10mg ELISAKitforHumanNeurogeniclocusnotchhomologprotein4
龙脑;2-茨; 天然冰片; 右旋龙脑 20mg Borneol ELISAKitforHumanInterferon-inducibleproteinAIM2 HPLC≥98%