小鼠生殖细胞单细胞悬液制备的影响因素
良好单细胞悬液的制备必须首先考虑所用小鼠的日龄。因为随动物日龄的增加，精原细胞开始分化形成各级生殖细胞，其数目及所占生殖细胞的比例都逐渐下降，会给分离纯化增加困难。在成年小鼠的睾丸中，A型精原细胞只占所有精原细胞的1.25%，占未分化精原细胞的10.6%，仅占所有生殖细胞的0.03%［5］。因而用来分离精原细胞的动物的日龄应较小为好。一般小鼠选用生后8d的［2］，但也有人选用生后10d的；大鼠则选用生后9d的［6］。根据我们的前期工作并参考有关报道［2，3］，7～8d小鼠的生精上皮内基本只有A型精原细胞和支持细胞，其他各级生精细胞尚未发育形成，理论上可获得zui大量的精原细胞。
其次，采用适当的程序及消化方法也是制备良好单细胞悬液的关键环节之一。从小鼠体内取出睾丸之后，我们先用尖镊仔细去除脂肪垫及睾丸白膜，将曲细精管在PBS中吹散，尽量将间质吹打成单细胞及组织碎片。通过静置或低速离心，将其去除，获得较为纯粹的曲细精管段。然后采用两次较短时间的胶原酶消化，将没有消散的睾丸间质消散并释放大部分管周肌样细胞，zui大程度地减少了间质组织及管周肌样细胞的污染。zui后采用胰蛋白酶、EDTA复合消化液消化，释放支持细胞和精原细胞。实验结果表明，这种程序性的消化过程能有效地分离到较为纯粹的曲细精管段并制备出较高产量和活率的单细胞悬液，同时确保绝大部分间质成分，管周肌样细胞及睾丸外细胞的去除。
