产气荚膜梭菌病诊断技术

　　（1）检样中肠毒素检测取腹泻粪便加入生理盐水做成1：10的乳剂，离心后取上清液置微量U形底孔反应板上。以二倍递增稀释法稀释，做成以下三列。
　　
　　*列：检样稀释液+致敏红细胞（或致敏乳胶粒）。
　　
　　第二列：检样稀释液+未致敏的红细胞（或未致敏的乳胶粒）。
　　
　　第三列：已知量的肠毒素稀释液+致敏红细胞（或致敏乳胶粒）。
　　
　　RPHA在2h，RPLA在5～10h后进行凝集判断。若*列与第二列反应阳性的终点相同，则认为有非特异性凝集存在。在这种情况下，可于检样中加入等量的50％未致敏的血细胞（或乳胶粒）进行吸收后离心，取上清液再次进行试验。确定非特异性凝集吸收后，即可与第三列对照作比较，计算出毒素含量。
　　
　　（2）培养液中肠毒素测定在产气荚膜芽孢形成初期的菌体中含有肠毒素，当芽孢成熟，菌体崩解时即游离到培养液中。因此可用产芽孢培养基24～48h培养后，用超声波或溶菌酶处理，破坏菌体，离心所得到的上清液作检样。芽孢形成可用相差显微镜查明。肠毒素测定方法可用RPHA或RPLA。对培养液中肠毒素用RPHA或RPLA检测时，几乎看不到非特异性反应。
　　
　　（3）分离菌肠毒素产生性试验产气荚膜梭菌在试管内不易形成芽孢，故有时即使为食物中毒菌A型、C型或D型，也有看不到芽孢、测不到肠毒素的情形。常给予75~C20min的反复热刺激促使芽孢形成，并用促芽孢培养基。分离菌的肠毒素产生试验程序如下。
　　
　　被检菌液0．1-0．5ml，接种庖肉培养基，置37~C2～4h后，进行75℃20min热水浴处理，取出再置37~C2-4h再进行热处理。必要时可重复3～4次。取出0．1-0．5ml转种于硫乙醇钠培养基37~C6h，再接种促芽孢培养基37~C72h，取少许涂片镜检·，观察有无芽孢形成。若见到芽孢可进行肠毒素测定。
　　
　　（4）其他毒素测定。从食品检样中提取毒素可以25g无脂肪检样在lOOmlHEPES[N-（2-hydroxyethyl）peraz洫e-N，-2-ethaesulfonicacid]缓冲液中，以300r／min绞切1rain。将匀质物在5℃下，以20000r／min离心20min。取上清置冰箱内1～2h，用滤膜滤器滤过灭菌。置滤液于透析袋内，在15％一30％聚乙烯乙二醇（相对分子质量为20000）透析到少于lOml。可供下述各项试验用。
　　
　　溶血试验取o．5ml10．5％绵羊红细胞悬液于小试管内，加上述毒素抽提液0．5ml，置37℃水浴中经30min、60min、120min和24h，分别观察溶血情况。
　　
　　致死试验取0．2ml毒素抽提液注射几只小白鼠尾静脉内（或腹腔内注射o．5m1），观察3天，看其有无死亡。
　　
　　坏死试验以o．2ml毒素抽提液注射于家兔腹部皮下，连续3天观察注射局部有无坏死现象。
　　
　　将毒素抽提液以0．5ml量分别与0．5ml抗产气荚膜梭菌的标准血清（主要是A型至E型的抗毒素）混合，然后注射于小白鼠腹腔内，观察3天，看注射小鼠有无死亡。根据注射小鼠被动保护作用，确定毒素型别。
　　
　　注：HEPES缓冲液使用浓度一般为10-50mmol／L，可以根据缓冲液能力的要求而定。
　　
　　10mmol／LHEPES的配制，称取0．2385gHEPES，加入到l00ml培养液内溶解，用lmol／L*调至pH7．o～7．2，过滤除菌后使用。