冻融工艺在mRNA疫苗中应用

   信使RNA（mRNA）是一类新兴的生物治疗药物。虽然它们有相当大的前景，但这一领域仍处于起步阶段。mRNA治疗为挑战性疾病的靶向治疗和灵活生产提供了新的机遇，抗C O V ID - 1 9的mRNA疫苗的快速发展就证明了这一点。

   mRNA的临床潜力已经超出了疫苗的范畴，扩展到其他先*的治疗方法，例如蛋白质替代、基因治疗和癌症免疫治疗。

   由于mRNA是脆弱的，不稳定的，开发 mRNA 疫苗的最重要的挑战仍然是其固有的不稳定性，因为它很有可能在冰点以上分解。

   mRNA 构建模块的修饰以及能够相对安全地包裹它颗粒的开发帮助了mRNA 疫苗候选者。但是这种新型疫苗仍然需要冷冻条件存储、运输和管理。

WHO世界卫生组织在对mRNA在冻融方面的建议 ：

Specific attention should be given to minimizing the degradation of the mRNA during encapsulation with the LNPs and under manufacturing conditions known to influence the stability of the LNPs and final mRNA-LNP vaccine product (for example, the impact of thawing of the mRNA and the freezing rate of the LNPs or mRNA LNPs).

在用 脂质纳米粒 包封期间以及生产条件下应特别注意尽量减少 mRNA 的降解，这个包封和生产添加会影响脂质纳米粒及最终 mRNA-LNP 疫苗产品的稳定性，例如：产生的影响条件包括mRNA解冻和LNPs或mRNA-LNPs的冷冻速率。

（WHO：Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations

已上市的某mRNA产品中在研发到生产中的冻融应用

Assessment report---C O V I D - 1 9 Vaccine（根据某上市的mRNA疫苗的评估报告---EMA）

Characterisation 特征  

The applicant provided a detailed characterisation of the mRNA active substance including detailed information on the structural properties of the mRNA CX-024414. Additionally, data on the chromatographic profile, the thermal denaturation as well as freeze thaw degradation and their influence on protein expression have been provided.

申请人提供了mRNA活性物质的详细特征，包括mRNA CX-024414结构特性的详细信息。此外，还提供了色谱图、热变性和冻融降解及其对蛋白质表达的影响数据。

评：该公司提供了向监管机构提供了冻融降解的数据，以及冻融对蛋白表达的影响数据

The composition of the finished product

最终产品的成分Sucrose is added to promote product stability through freeze/thaw and long-term storage.

添加蔗糖是为了通过冷冻/解冻和长期储存来提高产品的稳定性。

评：该公司-采用蔗糖来提高冻融和存储稳定性

Manufacturing process development

生产工艺开发

mRNA-loaded LNP intermediate  载有 mRNA 的 LNP 中间体

The product consists of an mRNA-lipid complex dispersion that contains the mRNA (CX-024414) that encodes for the pre-fusion stabilised Spike protein of 2019-novel Coronavirus (SARS-CoV-2) Comprehensive development data have been provided. Changes made during development have been described. They included scale-up, addition of a bulk freezing step, change of some equipment and revision of the lipid molar ratios to allow for harmonisation with the platform process.

该产品由一种mRNA-脂质复合分散体组成，其中包含编码2019年XIN XING冠状病毒（SARS-CoV-2）融合前稳定 Spike 蛋白的mRNA（CX-024414）。已提供全面的开发数据。已经描述了在开发过程中所做的变更。它们包括放大、增加批量冷冻步骤、改变一些设备和修改脂质摩尔比以与平台工艺匹配。

评：---在生产工艺开发过程中增加了大体积冷冻步骤。

Manufacture of the product and process controls

产品生产和工艺控制---涵盖了冷冻工艺

The LNP manufacturing process comprises lipid stock solution (LSS) preparation, nanoprecipitation mixing, tangential flow filtration (TFF), dilution and cryoprotectant addition, clarification, fill, and freezing and storage.

LNP 制造过程包括脂质储备溶液 (LSS) 制备、纳米沉淀混合、切向流过滤 (TFF)、稀释和冷冻保护剂添加、澄清、填充以及冷冻和储存。

评：---在生产产品过程中冷冻和存储是分开的。产品经冷冻后存储。工艺步骤必须关注批次间和批次内的均一性，冷冻速率是关键参数。

Stability of the product

产品的稳定性

mRNA-loaded LNP intermediate载有 mRNA 的 LNP 中间体

Stability studies in support of mRNA-loaded LNP intermediate freeze-thaw cycling were performed using the development lot. The results show that the mRNA-1273 LNP biophysical attributes (particle size, polydispersity, encapsulation) are not impacted by the different freeze-thaw processes (room temperature or 2°C to 8°C) or 5 cycles of freeze-thaw

使用开发批次进行了支持负载 mRNA 的 LNP 中间冻融循环的稳定性研究。结果表明，mRNA-1273 LNP 生物物理属性（粒径、多分散性、封装）不受不同冻融过程（室温或 2°C 至 8°C）或 5 个冻融循环的影响，还进行了支持成品冻融循环的稳定性研究。冻融循环最多重复五次。所有结果都在规格范围内，表明最终产品在重复冻融步骤方面相对稳定，支持五个冻融循环。然而，批准的产品信息中不允许在上市时反复冻融小瓶。

评：--经优化的冻融工艺在规格范围内，该公司的公司对产品的稳定性没有影响

Design and conduct of clinical studies

临床研究的设计和执行---仍需要评估冻融的稳定性，涵盖运输和存储

The RT-PCR assay is acceptably validated and additional validation studies to evaluate stability of clinical samples at various temperatures and freeze/thawing cycles to cover shipping and storage conditions were provided.

RT-PCR 测定得到了可接受的验证，并提供了额外的验证研究，以评估临床样品在各种温度和冷冻/解冻循环中的稳定性，以涵盖运输和储存条件。

评：在临床解冻做的冻融稳定性实验，涵盖运输和存储，为后期上市做准备

该公司的冻融工艺条件是什么?

该公司冻融工艺的开发过程中，和SUS做了紧密合作，SUS根据此公司的要求，开发相应的工艺配方。

1. 特殊要求的冻融曲线降低了对mRNA产品的影响，影响主要来源于以下三个方面：

The goal must be to reduce STRESSES DURING FREEZING

目标必须是在冻结过程中减少压力  

Stress is coursed by:

压力主要这几方面

• CRYOCONCENTRATION冷冻浓缩

• PH SHIFT pH pH漂移

• PROTEIN INTERACTION WITH THE ICE SURFACE蛋BAI BING液界面的变性

2. mRNA Freezing experience

mRNA冷冻实验 得到的工艺数据。

mRNA experienced companies are freezing as fast as possible, so with rates from + to -60° C in < 5hours

经验丰富的mRNA公司会尽可能快地冻结mRNA（在< 5小时内从+到-60°C冻结）

SUS公司SUS专注于下游到灌装之间的解决方案。一体解决方案的产品涵盖袋子保护壳RoSS，分装设备RoSS.Fill，冻融设备pFTU，RoSS.Ship运输等

SUS的产品特点：YI LIU 的技术

RoSS保护壳的ZHUAN LI技术，WAN MEI保护了袋子的安全；

RoSS.Fill快速精确分装，超高灵活性和安全性；

冻融设备大容量，超低温，WAN MEI的冻融曲线；

RoSS.Ship 超长的保温时间和超高安全的运输方式。

现在RoSS.Fill分装系统和冻融系统在QUAN QIU已经超过200多个用户。

研熠作为SUS在中国的合作伙伴，提供SUS产品的技术咨询、产品销售和技术服务等。