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“捧杯”秘籍——高质量质粒制备

来源:百林科医药科技(上海)有限公司   2022年12月02日 13:19  
 

 

  姗姗来迟的世界杯,总算给朋友圈提供了第二谈资。32支球队,有传统强队,也有后起之秀。为了捧起大力神杯,各家纷纷使出十八般武艺。这种热闹场面,好比盛况的生物制药市场。Me-Too和Me-Better都讲究速度与激情,抓住工艺的CPP,才能俘获CQA的芳心。
 
  今天小编就从时下热点——质粒 入手,分享上下游工艺中的“捧杯”秘籍。
 
  质粒DNA应用
 
  细胞和基因治疗技术已成为生物医药领域最近几年的新热点,同时带动了相关生物技术和产业的蓬勃发展。质粒DNA,既可以作为核酸疫苗或核酸药物单独使用,也可作为mRNA药物生产中的模板材料,还可以在重组病毒载体生产中作为病毒包装的原料。随着细胞和基因治疗、mRNA药物的飞速发展,质粒DNA的需求与日俱增。因此,制备高纯度、高质量的超螺旋DNA,始终是细胞和基因治疗领域企业的重要工作目标。
 
  质粒DNA生产工艺流程图(经典三步法)

 

 
  质粒DNA生产流程
 
  1  大肠杆菌发酵
 
  发酵主要是在感受态选择、培养基、培养方式、营养物质、溶氧、pH、温度等方面进行优化。质粒的扩增得益于大肠杆菌规模化高密度发酵来实现,如何进行高密度发酵,并在有限的发酵液中得到高质量的质粒DNA,减少下游纯化压力,是上游发酵需要持续解决优化的方向。
 
  2  菌体收集
 
  发酵结束,通常采用离心的方式收集菌体。考虑中试放大的可行性,规模化生产建议采用中空纤维切向流过滤收菌的方式,推荐使用750KD或0.1、0.2μm的中空纤维。
 
  3  菌体裂解
 
  经典裂解工艺还是三步碱裂解法,重悬(50mM Glucose,25mM Tris,10mM EDTA ,pH 7.5~8.0)→碱裂解(0.2 M NaOH ,1% SDS)→中和(3M 乙酸钾, 2M CH3COOH pH 5.0)。小试阶段通常采用手动操作,由于手动操作的不确定性及不可放大性,会出现不同批次裂解效果不同的差异,中试放大后,存在裂解效率降低,开环占比增加的风险;因此保证产品中试阶段高质量的稳定性,批次间一致性,也是工艺人员需要考虑的重点。
 
  4  澄清
 
  裂解中和后的液体,存在很多固体杂质,需要澄清后才能进行下一步工序。通常选择嚢式滤器或深层滤器过滤澄清。
 
  5  超滤浓缩
 
  澄清后上清液通常采用50KD或100KD的切向流超滤膜组件进行合理的浓缩和洗滤,以达到方便下一步层析纯化的要求。在大规模质粒生产时,需要提高工艺可放大性和合规性。其中,材质和孔径选择、TMP优化和剪切力是比较关键的地方。
 
  6  层析纯化
 
  6.1 凝胶过滤层析
 
  使用百林科Chromstar 6FF纯化,此过程工艺目的是去除RNA。在合适的盐浓度下,质粒和RNA分子大小差异最大。样品流经层析柱,质粒先出,RNA后出,从而实现分离。上样量在0.1~0.25CV之间,推荐上样线性流速60 cm/h,工艺放大柱高建议30±5 cm,具体参数条件建议客户根据实际工艺情况进行摸索。
 
  Buffer A:2.1M (NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5

 

 
图1:Chromstar 6FF层析图谱
 
  结果:Chromstar 6FF 柱纯化后,质粒与RNA有效分离。
 
  6  层析纯化
 
  6.2 亲和层析
 
  此步骤工艺目的去除开环质粒等杂质。百林科MaXtar PlasmidCap HR填料能够特异性的结合超螺旋质粒,载量达到2mg/ml。样品流经层析柱,在合适工艺条件下,开环质粒流穿,超螺旋质粒结合在填料上,经洗脱收集,从而实现超螺旋质粒和开环质粒的高效分离,此层析步骤还有去除HCD的能力。
 
  典型Buffer推荐如下:
 
  Buffer A: 2.1M (NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5
 
  Buffer B: 1.7M (NH4)2SO4,0.3M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl pH 7.5

 

 
图2:MaXtar PlasmidCap HR层析图谱
 
  结果:MaXtar PlasmidCap HR填料纯化质粒样品可实现对开环质粒和超螺旋质粒的分离,超螺旋质粒纯度可以达到90%以上。
 
  6  层析纯化
 
  6.3 离子交换层析
 
  经过Chromstar 6FF和MaXtar PlasmidCap HR纯化后的超螺旋质粒的内毒素含量已经很低,经过MaXtar Q HR进一步纯化,可以有效将内毒素控制在合格范围内。
 
  典型Buffer推荐如下:
 
  Buffer A:0.4M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5
 
  Buffer B:1.0M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5

 

 
图3:MaXtar Q HR层析图谱
 
  结果:经MaXtar Q HR填料纯化后,回收率>85%,内毒素含量<10EU/mg。
 
三步层析数据汇总表

 

 
  * 根据超螺旋质粒含量计算
 
  7  浓缩换液
 
  纯化后超螺旋质粒经过UF/DF调整浓度及置换缓冲液,除菌过滤,储存备用。
 
  质粒三步法的工艺优势
 
  层析三步法已广泛应用于不同领域,适合建立平台化的质粒纯化方案,以减少工艺开发工作量。相较于其他质粒工艺路线,适用于不同大小分子范围,面对不同质粒的上游表达量,RNA等杂质含量以及发酵的批间差异,能够很大程度保证产品质量,平台通用性较强,优势明显。
 
  与此同时,百林科也可以根据客户不同应用的质量需求定制开发纯化路线。
 
  订货信息

 

 

 

 

 

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