液-质联用研究红豆杉提取物中紫杉烷类化合物

摘要：建立了一套利用反相液相色谱和大气压化学电离质谱联用技术分析红豆杉提取物中微量紫杉烷类化合物的方法。通过研究已知的10种紫杉烷类化合物的保留时间、质谱特征，初步建立了一个紫杉烷类化合物的数据库，利用这些数据可快速鉴定红豆杉提取物中已知的紫杉烷类化合物，并能够对未知化合物做一定程度的结构分析。这种研究方法同样对其他天然产物特别是微量成分结构分析具有指导作用。
    关键词：紫杉醇，大气压化学电离质谱，紫杉烷类化合物
    引 言
    紫杉醇是zui早从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）茎皮中分离得到的一种二萜类化合物，用于治疗顽固的卵巢癌和乳腺癌。然而紫杉醇资源有限，极大的限制了它的临床应用。在紫杉烷类化合物中，许多物质都有抗肿瘤活性，还有一些可以通过结构改造合成紫杉醇甚至药效更好的化合物。无论是研究红豆杉提取物中的紫杉烷类化合物还是结构改造中的中间产物，都需要而灵敏的分离鉴定手段。液相色谱较早被用于紫杉烷类化合物的分离和紫杉醇的定量分析，质谱也被广泛的应用于紫杉烷类化合物的分析鉴定。实验研究了紫杉烷类化合物的正离子大气压化学电离质谱，找到了这些物质的质谱特征，并建立了利用反相液相色谱和大气压化学电离质谱联用技术研究红豆杉提取物中微量的紫杉烷类化合物的方法。
    2 实验部分
    2．1 试剂与仪器
    LCQ Advantage质谱仪（美国Thermo Finnigan公司）。乙腈为HPLC纯；水由法国Millipore公司的Milli-Q水纯化系统制备；甲醇、氯仿、正己烷、乙酸乙酯为分析纯；柱层析用硅胶（上海五四化学试剂有限公司，75～150μm）。巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ、紫杉醇、10-去乙酰基．7表紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰基．7-表三尖杉宁碱、10-去乙酰基-7木糖基三尖杉宁碱、10-去乙酰基-7木糖基紫杉醇、10-去乙酰基-7-木糖基紫杉醇C、7-表紫杉醇由本实验室制备，并经核磁共振检测确认。质谱条件：全范围扫描100～1000；壳气（N2）：65单位，辅助气（N2）：20单位；放电电流5μA；蒸发器温度465℃，毛细管温度180℃。色谱条件：MetaChem公司的Taxsil-3柱（250mm×4.6 mm）；流动相：乙腈：水（49：51），流速：0.8mL／min，柱温：35℃。
    2．2 样品的处理
    取干燥的南方红豆杉（Taxus mairei）树皮1kg，粉碎至小于250μm，用甲醇浸提3次（5L×3），每次10h，浓缩浸提液，用正己烷萃取3次（2L×3），正己烷层舍弃，然后用氯仿和水萃取3次（2L×3），氯仿层浓缩干燥。上硅胶柱。以乙酸乙酯：正己烷（1：1）为流动相淋洗，收集相应的馏分，旋转蒸发得到。
    3 结果与讨论
    3．1 已知的紫杉烷类化合物的分析
    通过分析已有的紫杉烷类化合物可以初步建立一个有关紫杉烷类化合物的数据库，从而可以快速方便的分析红豆杉提取物、中间产物。列出用1O种常见的紫杉烷类化合物的分子结构信息、分子量和相对保留时间。利用液相色谱在上述条件下分析这些紫杉烷类化合物，得到各个化合物的相对保留时间，即这些化合物的色谱特征数据，从而便于实验室之间数据的比较对照。利用化合物在反相色谱中保留时间的长短还可以大致衡量其亲脂性强弱，有助于是解释未知紫杉烷类化合物结构。
    在液-质联用中通过质谱分析可以获得相关化合物分子量以及与结构相关的碎片离子的信息，结合液相分析得到的化合物亲脂性的信息，可以快速对化合物进行结构鉴定。10种化合物的离子碎片离子说明了这些碎片离子的产生方式。这些化合物的质谱有许多共性，所有这些化合物都有与紫杉醇相同的母环结构，zui后都会生成，m／z=509的母环特征离子；由于母环上取代基不同，各个化合物还会生成许多特征的离子，主要包括以下3类：*类是关于13位上侧链的特征离子，许多化合物的侧链和紫杉醇的（m／z=286）相似，仅仅是氨基所连的官能团（R1）有所差别。这可以根据侧链离子的荷质比加以判断，比如1O-去乙酰基．7-木糖基紫杉醇C以戊烷基代替了紫杉醇的苯基，所以它侧链的特征离子m／z=280，比紫杉醇小了6；其次如三尖杉宁碱类的侧链，氨基上连一个2-丁烯基，所以m／z=264；还有一些在13位没有连大分子的基团，就不会有相应的特征离子，如10-乙酰基巴卡亭11I和巴卡亭Ⅲ，它们13位都是羟基，所以没有相应的碎片离子。第二类是关于10位上所连的基团的，由于1O位的基团脱去后可以与11位的双键形成能量较低的稳定共振结构，所以10位上的基团很容易脱去形成相应的中性碎片丢失，如果10位连的是乙酰基，准分子离子就很容易形成60的中性碎片丢失，如果连的是羟基，则易形成18的中性碎片丢失。第三类是关于7位的，许多化合物在7位有相同的官能团， 只是键的空间位置不同，这些化合物的质谱基本上是一样的。考虑到大部分的紫杉烷类化合物拥有与紫杉醇相似的结构，特别是有与紫杉醇一样的母环结构，所以这些物质会和紫杉醇及其他的标准紫杉烷类化合物经历相似的裂解途径。相同的特征离子和中性分子丢失，说明含有相同的结构，相对应的不同离子则说明了结构上的差异。因此，用APCI／MS可以做这类化合物的精细结构解析。
    3．2 液-质联用分析红豆杉提取物
    3．2．1 未知化合物分子量的确定图2是紫杉醇纯化过程中一个中间产物的UV图（227nm）和质谱总离子流图。这两幅图有很大的一致性，大部分的化合物通过液相色谱得到了很好的分离，为质谱分析创造了良好的条件。由于产物的成分非常复杂，还有一些化合物无法达到*分离，可以凭借质谱的质量分析能力进行分析。尽管有其他化合物离子峰的干扰，但还是可以判断保留时间为14.18min的是三尖杉宁碱。
    3．2．2 提取物中紫杉烷类化合物的初步分析 迄今为止，已经发现了300多种紫杉烷类化合物。由这些化合物的结构式可以知道其分子量，利用质谱的选择离子扫描可以初步判断某一混合物中是否含有这些化合物，然后再根据质谱的图谱加以确认。利用选择离子扫描方式分析上述中间产物而发现的一些可能的紫杉烷类化合物的色谱图。对于还未被发现的新化合物也可以根据质谱图，对其结构做一些判断。例如，根据化合物是否形成m／z=509的母环特征离子可以判断该化合物是否有和紫杉醇一样的母环。
    3．2．3 未知化合物的质谱分析 因为许多紫杉烷类化合物有相似结构，相近裂解途径，故用APCI／MS可以做这类化合物的精细结构解析。以图出峰时间为7.21 min的未知化合物为例，说明用质谱分析化合物结构的方法。图显示了该化合物的大气压化学电离质谱，对照图的紫杉醇的质谱图：它的侧链形成m／z=268.1的离子，其母环在脱侧链之后该化合物形成了m／z 509.1和527.1的离子，说明该化合物的侧链与紫杉醇一样，而母环含有与l0-去乙酰基-7 表-紫杉醇相似的结构；准分子离子峰的m／z 943.9，比l0-去乙酰基-紫杉醇大132.1，同时在该物质的图谱中有准分子离子峰脱去149.9得到的m／z=794.0的离子峰；而且该物质在色谱中的出峰时间（7.2l
min）比紫杉醇（15.92min）早，说明该物质比紫杉醇亲脂性弱；综合这3项，参照其分子量信息及已有的紫杉烷类化合物的资料，基本可以确定该化合物在母环上比紫杉醇多一个木糖基，可能是l0-去乙酰基-7-木糖基-紫杉醇。
    3．3 结论
    本实验利用液相色谱-大气压化学电离质谱联用研究紫杉烷类化合物标准样品，得到这些化合物的液相色谱保留时间、质谱特征图谱以及质谱裂解规律等信息，据此可以建立一个有关紫杉烷类化合物的数据库，用于红豆杉的粗提物、纯化紫杉醇过程中的中间产物的分析，本实验所用的方法也适用于其他天然产物的开发和研究，特别适用于微量成分的分析。
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