液质联用技术鉴定rLTB的结构

摘要：目的利用电喷雾离子化为接口（ESI）的液相色谱／质谱联用技术（HPLC—MS），鉴定重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（rLTB）氨基酸序列结构的正确性。方法利用SDS—PAGE分离、呈现蛋白混合物，胰蛋白酶原位水解rLTB．HPLC—MS联机制备肽指纹图，分析肽指纹图获得rLTB氨基酸全序列信息。结果 rLTB的全序列结构与理论的全序列结构*一致。结论改进的HPLC—MS测定条件稳定，提高了质谱灵敏度，结合肽指纹图的分析结果，可以验证蛋白质的氨基酸序列。
关键词：rLTB；原位酶解；HPLC—MS；肽；指纹图谱
The Structure Identification of rLTB by HPLC-MS
YANG Jun，TIANG Wen—Biao，ZHU Yong—Hong，ZOU Quan—Ming
（Department of Clinical Microbiology，3bird Military Medical University，Chongqing 400038 China）

ABSTRACT：Aim 3he correcTESS of the primary structure of recombinant heat—labile enterotoxin B was identified by liquid chromatography／electrospray ionization mass spectrometry．Methods rLTB in SDS— PAGE gel was digested by trypsin，an d its peptide finger mapping Was m pared by improved HPLC—MS methods．By an alyzing peptide finger mapping，the primary structure of rLTB Was identified ．Results： 3heoretic an d actual primary structure of rLTB is consistent．Conclusion Improved HPLC — MS conditions were stable．3he sensitivify of MS Was increased ．Whole amino acid sequence of proteins were detected ．
KEYWORDS：rLTB；Tryptic digestion in gel；HPLC—MS；Peptide finger ma pping

    大肠杆菌不耐热肠毒素（heat—labile enterotoxin，LT）是产毒素性大肠杆菌（enterotoxigenic E．coli，ETEC）分泌的一种热不稳定性肠毒素，由A、B二个亚单位组成，其中A亚单位通过其GTP依赖的ADP一核糖基化转移酶活性引发毒素效应，B亚单位可以与真核细胞表面的GM1一神经节苷脂受体特异结合，帮助A亚单位进人细胞，结合到靶细胞上。由于LT的B亚单位（LTB）的毒性低，粘膜免疫佐剂活性高，在口服蛋白疫苗研究中，作为诱导机体产生粘膜免疫反应的佐剂，引起广泛的兴趣。
    8O年代末二种软电离技术的发明，使质谱迈人了生物大分子的研究领域，并极大地推动了蛋白组研究进程。其中一种软电离技术是电喷雾离子化（eleetrospmy ionization，ESI），ESI能产生多电荷峰扩大了分子量的测定范围，同时提高了灵敏度和准确性。HPLC能分离得到较多的蛋白满足后续的鉴定，与质谱（MS）直接连接使用自动化程度高、重复性好。基于这些优点，随着HPLC—MS的发展和改进，成为了蛋白组学研究的核心技术。利用DNA重组技术将LTB基因通过合适的载体克隆到易于操作和培养的宿主细胞中进行表达，再分离纯化表达产物，即rLTB。验证rLTB氨基酸全序列的正确性是基因工程产品质量控制的重要指标。肽图谱（peptide mapping）是蛋白质经水解后测定肽段以获得相关的信息，是生物制品高特异的鉴定方法。目前主要有液相肽图和质谱肽图，前者根据肽段在色谱柱上的分离行为差异而获得，主要检测蛋白质制品的稳定性，后者经色谱柱分离后通过质谱分析每个肽段的准确分子量，从而鉴定蛋白质的初级结构。色谱分离蛋白质和肽zui常用zui有效的流动相体系是乙腈、水和三氟乙酸，但对于电喷雾质谱（ESI—MS），三氟乙酸根是具有强离子对效应的阴离子，与质子化肽段生成电中性的离子对，抑制多肽ESI—MS的质谱信号。本文采用了改进色谱条件，直接HPLC—MS联机检测，获得rLTB的HPLC肽图和Ⅲ，LC／MS肽图并验证了rLTB的氨基酸全序
列结构。
1 材料与方法

1．1 试剂与仪器：色谱纯乙腈、三氟乙酸（TFA）、乙酸（均为美国TEDIA公司产品）；超纯水的电阻率为18．2MI2；胰蛋白酶[（经11PICK处理）为Promega公司]；rLTB（由本教研室纯化组提供，批号011205）。其余试剂均为分析纯。流动相A：1000ml超纯水。流动相B：乙腈800ml和水200ml。胰蛋白酶溶液：用缓冲液将胰蛋白酶配制成1mg/ml 的溶液。1100HPLC／1946B型液质联用仪：在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、光二极管阵列紫外可见分光光度检测器、ESI接口的四极质谱检测器（均为Agilent公司）。色谱柱Zorbax 300SB．C18（5tan，2．1mm×150mm）；保护柱Zorbax 300SB．C18（5μ，2．1mm×12．5mm，均为Agilent公司）。

1．2 方法

1．2．1 SDS—PAGE电泳条件：采用15％分离胶，5％浓缩胶，rLTB上样量10μg，聚集电压80V，lh，分离电压65V，3h。考马斯亮蓝染色。

1．2．2 胰蛋白酶水解方法：用刀片从电泳胶上切下目的蛋白带，将其切成1mm2大小的胶块。放人含有50％ 乙腈，50mmol/L 的NH4HC03溶液中，摇床上25Or／rnin，20min震荡清洗，重复三次。将胶片置鼓风干燥机中70℃干燥，30min。加人2O 酶溶液和2O 的50mmol/L 的NH4HC03溶液，盖上塞，轻摇，37℃水浴18h。取出加人乙酸2Oμl 终止反应。

1．2．3 酶水解产物的HPLC—MS分析：将1．3．2处理过的样品经0．45μm孔径的滤膜滤过待用。HPLC色谱条件：流动相A和B；洗脱梯度B相从0％—60％ ，25min；保护柱和色谱柱；柱温40℃ ；流速0．25ml／min；上样量1Oμl ；检测波长分别为210nm。质谱条件：干燥气流速，12 l／min；辅助雾化气压力，40Pa；干燥气温度，350℃；电喷雾电压，4 000V；m／z扫描范围5O～3 000；裂解电压，120V；质谱扫描间隔0．20Da；扫描周期0．97s。

2 结果

2．1 rLTB的SDS—PAGE电泳和原位酶解：rLTB以包涵体的形式表达，通过包涵体溶解和二步纯化工艺处理，SDS—PAGE电泳分析rLTB纯化产品的纯度，见图1。rLTB的分子量为14 100，图1箭头所指的条带为rLTB，其纯度约86％。从图中可见rLTB纯化产品约有6～7条杂蛋白带。用小刀切下箭头所指的rLTB条带，按1．2．2方法进行原位酶解。

2．2 rLTB原位酶解结果分析：经TPCK处理的胰蛋白酶专一性酶切位点在肽链中K（LyS）和R（nrg）
的羧基端，水解后蛋白产生长短不等的肽段。rLTB理论氨基酸全序列见图2，共有124个氨基酸，含有16个精氨酸和赖氨酸，胰蛋白酶水解后理论上可以产生17个肽段或氨基酸。图2中T1-17为17个肽段的编号及所在位置，标在每个肽段的羧基端。

2．3 酶水解产物的HPI_E—MS分析结果：在分离多肽混合物时，一般在流动相中加入TFA（A相0．1％ ，B相0．085％），可以获得较好的色谱分离效果。但在液质联机中TFA会抑制多肽的ESI质谱信号，见图3。图3A、3B分别为流动相中添加TFA的色谱肽图和质谱肽图，图3A液相肽图中可见胰蛋白酶水解的肽段得到较好的分离，而图3B质谱肽图的样品信号几乎*被抑制了。图3C、3D为用乙酸（A相0．1％，B相0．1％）代替TFA添加到流动相中的液相肽图和质谱肽图。图3c液相肽图中峰的数目和保留时间与图3A液相肽图中基本一致，同时获得很好的质谱肽图见图3D。

2．4 rLTB质谱肽指纹图的鉴定分析：从图3D中提取各肽段质量数，进行肽段归属鉴定分析。表1列出rLTB胰蛋白酶水解所得肽段的实测质量数和理论质量数，以及二者之间的误差。

3 讨论
    HPLC -MS联机技术结合酶解可以检测蛋白质的氨基酸全序列，但对待测蛋白质的纯度要求较高（一般要求达到98％以上）。rLTB包涵体溶解后，经过二步纯化，其纯度虽然达到85％ 以上，仍不能满足液质联机氨基酸序列分析的要求。考虑到杂蛋白较少，见图1，SDS—PAGE一维电泳对其分离即可达到目的。我们采用SDS—PAGE上的原位酶解方法，即在凝胶中将rLTB水解成多个肽段，分子量较小的肽段容易离开聚丙烯酰胺的胶孔到溶液中。该方法蛋白质的水解充分，所得肽段的浓度较高，通过HPI_E—MS制备出较好的肽指纹图。
    蛋白质或多肽的色谱分离常在流动相中加入TFA，改善了色谱的分离效果，却抑制质谱信号，这对矛盾的存在，使HPLC—MS在蛋白质分析方面并不是一个的组合，有报道在液相检测器和电喷雾离子化室之间用“TFA—rEX”的柱后修饰可以极大地提高质谱检测的灵敏度。但是“TFA—fix”修饰需要一台高精度的溶剂添加泵，增加了检测程序和检测成本。为此本文改变液相流动相的条件，选择不具有强离子对效应的有机酸代替TFA，可以同时获得良好的色谱和质谱指纹图。通过比较不同比例的甲酸和乙酸，zui后筛选出在A、B流动相中分别加入0．I％的乙酸，达到较好的HPLC—MS检测效果。该方法简化了HPLC—MS检测步骤，弥补HPLC—MS在蛋白质分析方面的局限，可以同时获得较好的色谱和质谱肽指纹图，并通过质量数鉴定分析获得目的蛋白的氨基酸序列结构。

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