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揭秘贴｜如何5.8天内get靶向小分子的单B细胞来源抗体

来源：德国赛多利斯集团 2023年08月10日 09:34

　　在诊断和治疗领域，需要能够耐受复杂环境(如高有机溶剂、高盐、酸或碱)的抗体。兔源单克隆抗体(RmAbs)因其高亲和力和高稳定性而备受青睐，但传统针对小分子靶点的研发平台效能受限。

　　氯霉素(CAP)是一种抗菌剂，存在于动物源性食品中的CAP会对公共健康构成巨大威胁。中国农业大学动物源性食品安全检测北京重点实验室的王战辉团队于2022年发表在Analyst上的文章[1]，利用基于纳米孔的间接竞争性筛选利器(CSMN)仅20.6小时就获得了靶向CAP的兔源单克隆抗体分泌细胞(ASC)。结合分子生物学技术，该团队首次在5.8天内获得了一个靶向CAP的RmAb。该抗体检测真实生物样品中的CAP时，样本前处理更简单，并具有更短的检测时间、更好的重复性和更高的灵敏度。

　　 实验设计

　　与靶点是蛋白的抗原不同，CAP非常小，需要与BSA耦联后作为免疫原免疫动物，但耦联后除了CAP，连接子(linker)和BSA也有对应的抗体产生。为了得到特异性靶向CAP的抗体，利用下图所示的CSMN平台筛选特异性靶向CAP的ASC。

　　图1. 展示获得靶向CAP的RmAb的整个流程

　　• 预先用CAP-BSA包被纳米孔板表面12h

　　• 加入分离的脾细胞与PE标记的兔二抗混合液，静置10min使ASCs沉降到纳米孔里达到分离ASCs的目的

　　• 该纳米孔板置于37度、5% 二氧化碳环境中培养，ASCs会分泌抗体，与包被在纳米孔表面的CAP-BSA结合，再与悬液中PE标记的二抗结合产生荧光信号。4h后如在纳米孔内检测到增强的荧光信号，说明孔内有靶向CAP-BSA的ASC

　　• 4h时向孔内加入CAP，会与纳米孔表面CAP-BSA中的CAP竞争分泌的抗体，如4-8h荧光信号显著下降，则该纳米孔内的ASC是CAP特异性的ASC，如4h后信号仍很强则是靶向连接子或BSA的ASC

　　• 最后使用CellCelector全自动无损细胞分离系统结合直径为20μm的玻璃毛细管轻柔地将该ASC挑出，裂解后分离其mRNA先反转录，利用特定的引物扩增RmAb的轻、重链可变区，测序，真核表达得到靶向CAP的RmAb

　　从利用纳米孔板使ASCs分离为单个ASC，到连续成像追踪抗体的分泌，最后以抗体荧光信号改变作为筛选条件，把靶向CAP的ASC挑取出来，整个流程均由CellCelector一台设备在20.6小时内完成，充分体现了CellCelector的全能和高效。

　　图2. 三种不同ASCs明场采集的图片及0-8h RmAbs荧光信号的图片及对应荧光强度定量结果：(图2A)展示了纳米孔中靶向CAP的单个ASC细胞明场图片，在检测的0-8h内各时间点孔内分泌的RmAbs荧光信号变化；(图2D)4h加入的CAP前后因竞争使孔内荧光信号降低的模式图，以及各时间点荧光信号强度的统计图，先上升后下降(2E)；靶向BSA的ASC分泌的RmAbs会持续增强(图2B、F和G)，不靶向CAP或BSA的ASC检测不到抗体信号(图2C、H和I)

　　 纳米孔单细胞分离条件优化

　　图3. 纳米孔尺寸及接种的细胞密度对单细胞率的影响

　　CellCelector提供适用于不同目的的纳米孔板，每个纳米孔板含有十万到数百万个纳米孔。由于兔脾细胞直径约为8-13μm，为确保更高的单细胞率和挑取率，实验前测试了不同纳米孔尺寸(20μm到100μm)的四种纳米孔板(六边形的H100、UFO形的U40、UFO形的U25和方形的SIEVEWELL)的单细胞率，发现U25的单细胞率最高(图2A)。对于U25纳米孔，每孔接种的细胞数也需要优化，图2C-E每孔细胞数依次为5E3、1E4和2E4，细胞数越多，空孔率越低，但每个纳米孔含多个细胞的比例增加，1E4密度更合适。

　　 目标样品的挑取

　　CellCelector提供各种直径的挑头，用于挑取不同大小的贴壁或者非贴壁细胞，也可以快速挑取在半固体中培养的菌落和类器官等样本。

　　图4. 靶向CAP的单个ASC细胞挑取前后采集的图片

　　在挑取前，根据纳米孔内明场图片确认是否为单个ASC。然后，依据分泌抗体荧光信号的变化确定靶向CAP的ASC，进而进行挑取。挑取后，再次对该纳米孔成像(红线圈选区域)，CellCelector利用其成像功能为筛选全流程的准确度保驾护航。

　　 “屡试不爽”

　　下图是王老师团队同年发表在《Food and Chemical Toxicology》上的成果[2]，同样利用CSMN平台筛选靶向另外一个与食品安全有关的小分子——瘦肉精(RAC)，图中A、B、C分别展示了靶向RAC、BSA以及其他靶点的ASC在加入RAC前后各时间点纳米孔内分泌的抗体荧光信号的动态变化，最终筛选得到的RAC特异性RmAb可以在高尿素环境里检测RAC的水平。

　　图5.利用CSMN平台筛选靶向瘦肉精RAC的ASC结果

　　一年两篇文章利用CellCelector 高效筛选到靶向两个小分子的RmAb，是因为CellCelector具有以下优势：

　　• 一机全能，集分离、成像和挑取为一体

　　• Nanowell纳米孔板技术，每个纳米板含有十万到数百万个纳米孔，实现更高通量的细胞筛选

　　• 纳米孔板表面可根据检测目的进行各种修饰，满足多样化筛选需求

　　• 支持全板扫描，每次挑取仅需20-30s，实验操作时间短，自动化程度高

　　• 用于自动调整毛细管高度的SurePick™ 技术，在挑选过程中对毛细管高度进行动态调整，允许从高度不同或半固体体系中进行高效的全自动挑选

　　• 全流程存档记录及质量控制，完全自动化的质量控制过程，包括拣选前后的图像、拣选/失败报告和数据/图像输出

　　• 挑取对象广，适用于贴壁细胞，悬浮细胞或半固体培养基中的细胞、菌落以3D细胞团的挑取

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