毛细管区带电泳法测定地黄中梓醇的含量

摘要：目的： 测定生地、熟地及不同炮制时间地黄中梓醇的含量，考察炮制时间对梓醇含量的影响。方法：采用毛细管区带电泳内标法定量。用未涂层石英玻璃毛细管（60 cm×75μm，有效长度45cm），检测波长210nm，重力进样（10cm×5s），运行电压14 kV，温度20℃，背景电解质为50mmol/L硼砂溶液。进样前以0.5mol/L*溶液和背景电解质各冲洗3min。结果：该法平均回收率生地为98.2％，熟地为99.5％；RSD分别为2.1％和2.4％（n=5）。结论： 毛细管电泳法用于测定地黄中梓醇的含量方法简便快捷，灵敏度高，重复性好。实验证明，梓醇在生地的炮制过程中随时间的延长而降低。因此，梓醇在熟地黄中含量较少，以梓醇作为熟地黄的质量指标是不妥当的。
关键词：毛细管区带电泳；地黄；梓醇
六味地黄丸自创方以来，应用已有几百年的历史，是zui重要的中成药之一。中国药典一直缺乏其君药（熟地黄） 的质量控制方法，中华本草等文献认为可以梓醇做为其质量指标成分，我们用毛细管电泳法测定了不同炮制时间地黄中梓醇的含量，考察梓醇是否可以作为熟地黄的质量指标。
地黄为玄参科植物Rehmannia glutinosa Libosch．的块根，分鲜地黄（fresh Rehmannia root）、生地黄（dried Rehmannia root） 和熟地黄（prepared Reh—mannia root）3种。秋季采挖，除去芦头、须根及泥沙，鲜用者称鲜地黄；将鲜地黄缓缓烘焙至8成千者称生地黄；熟地黄为生地黄加绍兴黄酒后的炮制品。目前，地黄的临床应用主要以生地和熟地为主。传统中医理论认为，生地具有清热凉血，养阴生津的作用。用于热病舌绛烦渴， 阴虚内热，骨蒸劳热，内热消渴，吐血，发斑发疹；熟地具有滋阴补血，填精益髓的作用。用于肝肾阴虚，腰膝酸软，骨蒸潮热， 内热消渴，血虚伪黄，心悸怔忡，月经不调，崩漏下血，眩晕，耳鸣，须发早白 。梓醇具有缓泻利尿和降血糖等作用， 为地黄的有效成分之一。目前对地黄中梓醇含量的测定多采用HPLC法，用毛细管电泳法测定地黄中梓醇的含量尚未见有报道。本文用毛细管区带电泳法对生地、熟地及不同炮制时间的地黄中梓醇的含量进行了测定，方法简便快速，结果令人满意。
1 仪器和药品
毛细管电泳仪为美国Unimicro电泳仪（VUV-22型紫外检测器，HV-30 I高压电源）；梓醇对照品购自中国药品生物制品检定所； 内标物氢氯噻嗪为原料药， 沈阳药科大学药厂，含量大于98％；硼砂为分析纯；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。生地和熟地购于沈阳中街天益堂。由沈阳药科大学生药学教研室孙启时教授鉴定。
2 电泳条件
毛细管柱：未涂层石英玻璃毛细管（河北永年光导纤维厂，60cm×75μm，有效长度45cm），检测波长210nm，重力进样：10cm×5s，运行电压14 kV，温度20℃，背景电解质：50mmol/L硼砂溶液，进样前以0.5mol/L*溶液和背景电解质各冲洗3min。
3 溶液的制备
3．1 对照品溶液及内标溶液的制备 精密称取梓醇对照品6.0mg，用乙醇稀释至10mL，作为对照品溶液。精密称取氢氯噻嗪12.1mg。加乙醇至50mL作为内标溶液。
3．2 供试品溶液的制备将生地、熟地样品用剪刀剪碎后各取3g， 乙醇加热回流提取0.5h， 过滤，滤渣用乙醇洗3次，与滤液合并定容至25mL。取生地提取液0.2mL及熟地提取液1.5mL分别加入内标溶液0.4mL。加乙醇至2mL。作为生地供试品溶液和熟地供试品溶液。
4 线性关系的考察
用微量加样器分别取对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于5mL试管中。各加入内标溶液0.4mL，加乙醇至2mL。以梓醇与内标的峰面积比y为纵坐标，梓醇对照品溶液浓度（mg/L）为横坐标进行回归分析，测得标准曲线回归方程为：Y=1.1045X一0.0034， r=0.9999
线性范围为30～300mg/L。
5 精密度试验
取生地供试品溶液及熟地供试品溶液各进样5次，RSD分别为2.1％ 和2.4％，表明分析结果的精密度良好。
6 稳定性试验
生地和熟地供试品溶液在4℃冰箱中放置1，2，4，8，12，24h，梓醇与内标峰面积比值的RSD分别为2.8％和2.5％，n=6，结果表明在24h内稳定性良好。
7 重复性试验
取生地和熟地药材按供试品溶液的制备项方法各制备5份，按所选电泳条件进行测定，测得生地和熟地中梓醇含量的RSD分别为3.2％和3.7％，n=5。
8 回收率试验
取已测知含量的生地（1.12％）0.1 g和熟地（0.11％）1g各3份，加入一定量的梓醇对照品溶液，按供试品溶液的制备项方法制备所需溶液（生地提取液改取1.5mL），进样测定。
9 样品的测定
取生地和熟地供试品溶液。按所选条件进行测定，测得生地和熟地中梓醇含量分别为1.12％和0.11％，n=5，生地约为熟地的10倍，电泳图见图。
传统的地黄炮制方法是将地黄置于密闭铜罐中，加适量绍兴黄酒，直火加热24h即为熟地黄。本实验模拟传统炮制方法，采用加热回流的方法。取以上含量测定用生地约50g于250mL茄形瓶中，加入绍兴黄酒25g（约相当于药材重量的50％），于100℃水浴中回流。分别取回流0.5。1，2，4，8，12，16，24h的干药材各3g。照供试品溶液制备项下处理。考察不同炮制时间地黄中梓醇的大体变化规律见图2。图2以生地中梓醇含量作为1，纵坐标为不同炮制时间地黄中梓醇含量与生地中梓醇含量的比值。炮制24h时地黄中梓醇含量相当于生地中含量的8.5％，所测熟地中梓醇含量约相当于生地含量的10％，大致为炮制16h的样品。
1O 讨论
10．1 生地和熟地具有截然不同的药理作用，生地是清热凉血药，熟地为滋阴补血药。从两者的毛细管电泳图谱中可以清楚地看到，梓醇含量的差异是其zui大区别，而其它成分差别不大，我室将进行药理实验考察梓醇含量的差异是否为生地熟地药理作用差别的原因。
1O．2 生地中梓醇含量较高，可作为生地质量指标，炮制过程中梓醇大部分被破坏，故熟地不宜以梓醇做质量指标。
1O．3 从地黄炮制过程中梓醇的含量变化可以看出，在zui初的1h里，梓醇的含量急剧下降，从1h到24h逐渐下降，但十分缓慢。如梓醇含量确为导致生地和熟地药理作用差别的原因，则地黄的炮制时间有待改进。
10．4 现代中药药理手册等认为，生地中含微量梓醇，在生地炮制为熟地的过程中该成分大量增加。从本实验的结果来看，该说法有待商榷。
参考文献
1 National Bureau of Traditional Chinese Medicine《Chinese Materia Medica）Editorial Board（国家中医药管理局《中华本草》编委会）． Chinese Materia Medica （中华本草）． Shanghai（上海）：Shanghai Science and Technology Publishers （上海科技出版社），1996． 1745 （in Chinese）