层析技术--作为生物制药行业常用的分离纯化手段，广泛应用于抗体、疫苗、基因与细胞治疗、体外诊断等领域。其中，层析填料是层析技术的关键耗材。
根据前瞻产业研究院数据，2022 年全球层析填料市场规模预计达到 63 亿美元，其中生物制药是层析填料最为重要的应用领域[1]，随着中国生物制药行业的快速发展，层析填料的需求与日俱增，而其作为分离纯化的关键耗材，占据了下游生产大部分成本。各医药企业基于法规和成本的双重考虑：在不影响产品质量及满足产品收率的前提下，尽可能充分发挥填料的使用次数，延长填料的使用寿命，降低生产成本。
填料寿命研究开展的必要性
文献研究表明：由于层析填料在其生命周期内一直循环暴露于各种生物作用环境下，填料会发生一系列老化反应，如图1所示，包括配基问题(配基脱落、配基失活和配基闭塞)和柱床失效(基质污染、基质降解/变形)，进而影响到其纯化效果[2]。
图1(A)典型大规模生产使用protein A填料示意图(B)层析柱和填料被暴露于各种生物作用环境下(C)重复循环使用后填料老化示意图
因此，确定层析填料的使用寿命是一个非常重要的问题，各国监管部门也出于对药品安全性和有效性的考量，在其法规文件有明确规定：《中国药典》三部的“人用重组单克隆抗体制品总论”中提到需要验证纯化用材料(如色谱柱填料)的重复使用性的可接受性限度[3]；FDA在1997年的“人用单克隆抗体产品的生产和分析考虑要点”中要求必须要有预先设定的使用限值[4]。
如何开展填料寿命验证？
PDA TR14[5]，柱层析工艺的验证中总结了层析填料所需要的研究/验证及规模要求。有些验证需要在商业化生产规模上进行，而有些则只能在缩小模型上进行(见表1)。
表1 不同规模的验证研究
关于层析填料寿命验证，大部分企业会在产品正式进入商业化生产之前，使用缩小模型开展填料的寿命研究，通过对柱效、载量、纯度、杂质含量、收率等评判维度进行数据分析，以确定填料的循环使用寿命。
缩小模型采用线性缩小的原则，维持层析纯化的柱床高度、线性流速、上样载量、缓冲液/柱体积比值(CV数)以及洗脱收集标准不变，缩小层析柱的柱直径、体积流速和样品体积，同时关注层析柱压力、样品扩散、系统死体积和柱效等因素。
层析填料寿命验证评估维度
❖ 评估柱效(HETP、As)
❖ 动态结合载量
❖ 色谱图(峰高、峰宽、峰收集体积)
❖ 产品回收率、纯度
❖ 杂质残留(DNA、HCP、Viruses、Endotoxin…)
良好的填料维护对层析填料的寿命至关重要，层析填料的维护主要包括再生、清洁和保存，需要同步开展验证。
层析填料的清洁验证
影响层析填料寿命的最重要因素是层析填料的再生和清洁。PDA TR14[5]指出：在进行验证研究设计时就应考虑填料的再生方法，以便建立填料重复使用限度。在工艺研发阶段，就应研发有效的填料清洁程序以允许介质在多次生产批的重复使用并且提供充分的清洁。填料清洁程序的有效性将通过缩小规模前瞻性研究建立，然后在生产规模条件下，通过一个验证方案或者通过连续的监测进行确认。填料的清洁程序应有效，以阻止残留物的积累。这将最小化对后续批的残留，保持填料的性能。
层析填料的清洁验证可使用淋洗水方法或空白运行方法。检测的项目则包括TOC、总蛋白以及一些特定工艺相关杂质，比如宿主细胞蛋白和宿主细胞核酸等。可接受标准的话，一般采用行业标准，不过企业也可以自行设定标准，尤其是对于特定的工艺相关杂质。
层析填料的保存验证
PDA TR60-3[6]生物制药原液的工艺验证技术报告指出：应证明在预期寿命内保持层析填料性能特征所需要的保存时间和条件。尽管层析填料厂家可以提供填料的货架期、保存液的稳定性数据，但是仍然需要进行一定的层析填料保存验证工作。主要是因为供应商提供的层析填料保存数据是使用新鲜填料，并且在散装保存条件下进行。大多数生物制药的实际生产中，保存的层析填料往往是使用过的，而且很多时候是柱上保存，因此层析填料的保存验证应当考虑到这些实际条件，主要检测项目包括微生物、内毒素、功能等。
案例分享--百林科抗体亲和填料MaXtar ARPA寿命验证
利用含有单克隆抗体的细胞培养上清，对MaXtar ARPA 亲和层析介质进行了100个循环以上的测试，每个循环进行0.5 M NaOH 15 分钟的在位清洗，测试数据表明MaXtar ARPA亲和层析介质配基脱落水平较低，同时具有较高水平的动态结合载量(>70 mg/mL)，在进行100个循环试验后依然可以达到80%初始水平。在146个试验循环内，始终保持优秀的HCP去除能力，同时样品的SEC-HPLC表现出高纯度和高稳定性。
参考资料
1. 参考赛分招股书
2. Nweke MC, Rathore AS, Bracewell DG. Lifetime and Aging of Chromatography Resins during Biopharmaceutical Manufacture. Trend in Biotechnoly. 2018
3. US Food and Drug Administration (FDA). “Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use.” US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, February 1997
4. 2020 版《中国药典》三部 “ 人用重组单克隆抗体制品总论 ”2.1.1工艺验证
5. PDA Technical Report No.14 Validation of Column-Based Chromatography Processes for the Purification of Proteins
6. PDA Technical Report NO 60-3: Process Validation: A Lifecycle Approach Annex 2: Biopharmaceutical Drug Substances Manufacturing
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