整体柱，以其大而均匀且相互贯通的流道设计，对流传质的层析原理，为生物大分子，特别是分子直径在20nm以上、对剪切力较敏感的生物样品，提供高收率、高载量、高分辨率及快速纯化的层析解决方案。
今天，我们就来看看整体柱CIMmultusTM EV在外泌体纯化中的应用。
春风得意外泌体
2013年，诺贝尔生理医学奖授予了揭秘外泌体等囊泡的运输调控机制的美国科学家James E. Rothman、Randy W. Schekman和德国科学家Thomas C. Sudhof，使得外泌体领域逐渐火热。
外泌体是一种直径在30-150nm之间的细胞外囊泡，它具有脂质双分子层，其内可以包含多种物质，比如核酸、蛋白质和脂质，并表达跨膜蛋白和受体，可以促进细胞内通信。
外泌体广泛的分泌产生和存在于机体的各个部位，因此作为一种递送载体，它有着良好的生物兼容性，较低的免疫原性，可以长久的存在于血液循环中，并且可以通过血脑屏障。基于这些性质，外泌体在诊断、治疗都有着广阔的应用前景。
纯化难，多歧路
尽管外泌体有着非常多的应用优势，但是其在大规模生产中还是存在着许多技术挑战。就纯化过程而言：
• 现有的一些纯化外泌体的方法，比如：超速离心、PEG聚合沉淀、免疫亲和捕获等方式，都存在一些技术限制，比如：无法满足大规模外泌体分离的需求、成本高、特异性低等问题。
• 外泌体作为一种囊泡结构，对纯化条件和剪切力都非常敏感，传统的分离方式，比如传统颗粒填料层析，由于填料颗粒之间存在湍流，从而产生剪切力，对外泌体脂质双分子层的稳定性和收率都会产生影响。
• 外泌体本身直径较大，很难充分扩散到填料颗粒内部，从而导致载量较低。
• 外泌体属于细胞外囊泡的一种，而细胞外囊泡中的微囊泡和凋亡小体都与外泌体有一定的相似度，较难分离，因此，需要采用一种高分辨率的分离方式。
使用整体柱，更上一层楼
整体柱CIMmultusTM EV，专为外泌体纯化而设计，它能很好的解决外泌体层析纯化中的一些问题。
• 对流传质原理结合微米级别的宽阔流道，适合分子直径较大的外泌体样品的纯化，载量优势明显。
• 层流的模式，无湍流，极低的剪切力，适合囊泡样品的纯化。
• 对流传质，无扩散效应，分辨率高，可以满足分离不同类型细胞外囊泡的需求。
• 具有多种规格，可以实现良好的层析工艺放大。
图1. 基于整体柱CIMmultusTM EV的外泌体纯化解决方案
首先，在进行整体柱纯化之前，需要通过三步“TFF1-核酸酶解-TFF2”去除一定宿主细胞来源杂质，这其中就包括较难去除的染色质组分 (图1)。第一步TFF的主要目的是去除会抑制核酸酶活性的物质和部分杂质；然后引入耐盐核酸酶进行酶解，选择耐盐核酸酶是需要在高盐条件下将染色质中核酸和蛋白的相互作用打开，以便充分降解。酶解处理结束后再通过第二步TFF去除酶及降解后的杂质。
然后，使用CIMmultusTM EV整体柱进行纯化。纯化推荐条件如下：
• 平衡缓冲液：50 mM HEPES, 20 mM NaCl, pH 7.0
• 洗脱缓冲液：50 mM HEPES, 2 M NaCl, pH 7.0(线性梯度洗脱0-100%B, 20CV)
• CIP溶液：1 M NaOH, 2 M NaCl
• 流速：5CV/min
图2. CIMmultusTM EV整体纯化推荐条件
通过如下检测结果可以看到(图3)，经过最终CIMmultusTM EV纯化后，sEV即外泌体得到了很好的富集和浓缩，同时，与bEV和mEV实现了明显的分离。
图3. 流式细胞仪检测细胞外囊泡的情况
整体柱CIMmultusTM EV是专为外泌体纯化设计，从基质到配基都为外泌体纯化量身定制。同时，可提供各种规格的柱型从1mL至40L，具有良好的工艺放大性。
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